红鳍东方鲀抗苗勒氏管激素 （AMH）基因在不同发育时期的组织表达

为研究抗苗勒氏管激素 （AMH）基因在红鳍东方鲀Takifugu rubripes各组织和不同发育时期的表达情况以及在性别分化和性腺发育等过程中的作用，利用荧光实时定量PCR（qRT-PCR）技术对红鳍东方鲀成鱼的肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等组织进行了amh基因的表达分析以及不同发育时期（23、30、40、60、80日龄及2龄和3龄鱼）红鳍东方鲀个体水平上amh基因的表达分析。结果表明：红鳍东方鲀3龄成鱼脾脏、肾脏和肝脏中的amh基因表达量极显著高于其他组织 （P＜0.01），在精巢和心脏中的表达量极显著高于卵巢和脑 （P＜0.01），其中脾脏中表达量最高，脑中表达量最低；红鳍东方鲀23日龄、30日龄、2龄和3龄鱼中，雄鱼amh基因的表达量极显著高于同期雌鱼 （P＜0.01），而60日龄和80日龄时雌鱼表达量显著高于雄鱼 （P＜0.05），40日龄时雌、雄鱼的表达量无显著性差异 （P＞0.05），3龄时雌、雄个体性腺中amh基因的表达量均显著高于2龄鱼 （P＜0.05）；雄性幼鱼amh基因的表达量从23～30日龄呈增长趋势，且在30日龄时达到最高，随后逐渐降低，而雌鱼整体amh基因的表达量也呈现先升高后降低的趋势，80日龄时雌鱼amh基因表达量最高。研究表明，amh基因在红鳍东方鲀的性腺发育和性别分化过程中发挥着一定的作用。

红鳍东方鲀；实时定量PCR；抗苗勒氏管激素；基因表达

红鳍东方鲀Takifugu rubripes隶属于鲀形目Tetraodontiformers、鲀科 Tetraodontidae、东方鲀属Takifugu，俗称河豚、腊头等，是具有海江洄游习性的近海底层鱼类，素有 “鱼类之王”的美誉。野生型红鳍东方鲀精巢无毒，而且口感嫩滑，深受美食家的青睐，但是其内脏、血液和卵巢中含有一种神经毒素——河鲀毒素，误食容易引起中毒，严重时可导致死亡，因此，雄性红鳍东方鲀具有较高的经济价值和食用安全性。随着对红鳍东方鲀研究的不断深入，2002年，研究人员首次成功完成了红鳍东方鲀基因组的测序工作［1］。与人类的基因组相比，红鳍东方鲀缺少许多非必需重复序列，但大体上含有相同数目的遗传基因，而且一些位于基因编码区重要的调控区以及内含子/外显子结构高度保守［2］，这为深入研究红鳍东方鲀相关基因的功能特性提供了可靠的数据参考。

抗苗勒氏管激素 （Anti-Müllerian hormone，AMH），又名苗勒氏管抑制物质 （Müllerian inhibiting substance，MIS），是一种属于β-转化生长因子（TGF-β）超家族［3］的糖蛋白激素，具有调节生殖细胞发育及分化的作用。AMH的羧基端与TGF-β超家族成员有着高度的同源性，此家族的大多数成员要求在其羧基端第110个氨基酸的位点由蛋白酶水解切割后释放出具有活性的C端片段，从而被激活。在哺乳动物雄性个体胚胎时期，睾丸能够产生AMH诱导苗勒氏管退化，同时睾丸也分泌睾酮，诱导中肾管 （Wolffian ducts）的分化，发育成为附睾、射精管、前列腺等雄性生殖器官。在雌性胚胎，因为不产生这两种激素，所以苗勒氏管继续分化成为雌性生殖器官，如输卵管、子宫、上阴道等，这种作用在高等脊椎动物体内是高度保守的［4］。哺乳动物体内，雄性个体中amh基因始终保持高表达，直到青春期生殖细胞减数分裂开始时表达量降低；在雌性个体中，amh基因在新生儿个体的颗粒细胞中首次表达［5］。对于鸟类而言，amh基因在两性胚胎性腺中均有表达，只是通常在雄性胚胎中的表达量高；类似于哺乳动物，雄性鸟类的AMH能引起一对苗勒管的退化；在雌性鸟类中，只有左侧的苗勒管成熟，而右侧苗勒管会像雄性个体中的一样发生退化，这与雌性鸡胚胎性腺中amh基因表达形式相同［6］。两栖类和鱼类的amh基因拥有一个相同的表达模式：在性腺分化过程中，amh基因在精巢中的表达量高于卵巢，如美洲短吻鳄［7］、海龟［8］和鱼（比目鱼［9］、虹鳟［10］、斑马鱼［11］和罗非鱼［12］）；但青鳉性腺分化过程中amh基因并没有表现出二态型表达，只是在成年个体精巢中的表达量远远高于卵巢［13］。硬骨鱼中除鲟鱼外，尽管没有苗勒氏管，但是性腺的体细胞仍然表达amh基因，这说明amh基因可能与硬骨鱼的性别分化和性腺发育过程相关。

实时定量 PCR（Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction，qRT-PCR）是检测基因表达最有效的方法之一，尤其是对于表达量较低的基因［14］。qRT-PCR可直接通过监测扩增中的荧光信号变化获得定量结果，精确性高，在此过程中，定量和扩增同步进行［15］。本研究中，通过qRT-PCR对红鳍东方鲀3龄成鱼不同组织以及不同发育时期（23、30、40、60、80日龄、2龄、3龄）红鳍东方鲀个体进行了amh基因表达分析，以期为进一步研究红鳍东方鲀amh基因的功能提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

试验用2龄和3龄健康红鳍东方鲀取自大连富谷水产有限公司，雌、雄各3尾鱼，分别取其肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢和卵巢组织，保存于RNAlater试剂中，以备后续试验使用。

试验用健康红鳍东方鲀幼鱼取自大连富谷水产有限公司，分别于23、30、40、60、80日龄时采集同一批卵孵化的幼鱼个体各20尾，保存于RNA-later试剂中，以备后续试验使用。

1.2方法

1.2.1引物设计与合成 在NCBI上下载红鳍东方鲀amh mRNA序列，以其为模板，按照SYBR Premix Ex TaqTMⅡkit（Tli RNaseH Plus）引物设计原则，用Primer Premier 5软件［16］设计amh基因的qRT-PCR引物。将设计好的引物利用NCBI上的Primer-BLAST，在Takifugu rubripes的基因组和转录组下进行比对，结果显示，amh基因引物的特异性好［17］。内参基因选用红鳍东方鲀β-actin基因的引物［18］。引物序列由宝生物工程 （大连）有限公司合成，引物信息见表1。

表1　试验所用引物Tab.1 Primers used in this study

1.2.2总RNA的提取 用Trizol（宝生物工程大连有限公司）法提取2龄和3龄红鳍东方鲀肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢、卵巢和各发育时期幼鱼的总RNA，并通过琼脂糖凝胶电泳确定总RNA的完整性。

1.2.3cDNA第一链的合成和目的基因的测序鉴定 利用 OD260 nm/OD280 nm值为1.8～2.0的 RNA，按照PrimeScriptRTreagent Kit（宝生物工程大连有限公司）说明书的要求，通过反转录反应获得cDNA第一链。以合成的cDNA第一链为模板，利用合成的amh基因引物进行PCR扩增反应，获得amh基因片段。将PCR产物做切胶回收处理后得到的目的基因纯化产物与pUCm-T vector19载体 （生工生物工程上海股份有限公司）连接，导入到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，于37℃下过夜培养，进行蓝白斑筛选。挑取白斑，扩增培养后提取质粒，经琼脂糖凝胶电泳检测后的完整质粒送宝生物工程大连有限公司进行测序，以此来鉴定所用引物的可用性。

1.2.4标准曲线的制定 目的基因和内参基因分别设置5组标准品，并以水为模板作为阴性对照，每组设置3个平行。β-actin的模板是将上述cDNA原液按照100、101、102、103、104倍进行稀释。amh基因的模板是将上述cDNA原液按照50、51、52、53、54倍进行稀释。实时定量设备为ABI公司的Stepone plus荧光定量PCR仪，使用TransStart Top Green Qpcr SuperMix试剂盒 （北京全式金生物技术有限公司）。反应体系 （共20 μL）：2×Trans-StartⒸTop Green qPCR SuperMix 10 μL，Passive Ref-erence DyeⅠ（50×）0.4 μL，上、下游引物各0.2 μL，cDNA模板1.0 μL，DEPC水8.2 μL。采用三步法进行实时定量PCR扩增。反应条件为：95℃下预变性30 s；95℃下变性5 s，61℃下退火15 s，72℃下延伸10 s，共进行40个循环。

1.2.5相对表达荧光定量PCR β-actin和amh两个基因分别以上述获得的cDNA为模板，进行相对表达实时定量PCR，3龄鱼肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢、卵巢组织，2龄鱼以及各发育时期幼鱼的基因表达分别设置3个重复。

1.3数据处理

对于Stepone plus荧光定量PCR仪输出的相对表达实时定量结果，以相同模板β-actin的表达进行归一化处理， 进行 2-ΔΔCT数据处理［19-20］， 并将amh基因在各个组织、不同发育时期的表达量进行比较。利用SPSS 20软件进行数据单因素方差分析［21］，并通过Duncan法进行组间多重比较。

2　结果与分析

2.1总RNA提取

利用分光光度计测定，可明显观测到28 S、18 S和5 S三条带总RNA的OD260 nm/OD280 nm值，以此来确定RNA的浓度及纯度，OD值为1.8～2.0的总RNA可用于后续试验。

2.2目的基因序列的测序鉴定

利用BioEdit软件在测序结果中查找amh基因引物序列所在的位置，各自查找到引物序列后，再用MegAlign软件将amh基因的测序结果分别与其mRNA序列进行比对，序列完全吻合，证明引物可用。

2.3amh和β-actin基因引物特异性的验证

实时定量PCR结果显示，amh和β-actin基因的溶解曲线分别在86.2、88.0℃处有单一峰，且无杂峰，说明此次设计的amh基因引物特异性良好，符合实时定量PCR的要求，可以进行后续试验。

2.4amh和β-actin基因引物扩增效率的鉴定

用实时定量荧光PCR仪自动生成标准曲线，其纵坐标代表荧光信号到达阀值时所经历的循环数，横坐标代表模板的相对浓度 （设原模板的浓度为1时，根据稀释倍数，浓度依次递减）。amh基因和 β-actin基因引物的扩增效率分别为93.945%和103.877%，在90% ～105%范围内，线性程度在99%以上，说明两对引物可以用于2-ΔΔCT相对定量表达分析。

2.5红鳍东方鲀amh基因的组织表达

根据标准曲线中目的基因各个浓度CT值的大小，选择cDNA原液作为模板进行amh基因相对表达 （2-ΔΔCT法）实时定量PCR试验。分别提取性腺发育成熟的红鳍东方鲀肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢和卵巢组织的RNA后进行反转录，雌、雄鱼各3尾。将模板cDNA与实时定量试剂按要求混合后，用ABI公司的Stepone plus实时定量仪进行PCR反应，将获得的结果进行整理，结果表明，每个组织3个复孔之间的标准差均小于0.5。红鳍东方鲀amh基因的组织表达结果见图1。

从图1可见：红鳍东方鲀成鱼脾脏、肾脏和肝脏中的amh基因表达量较多且极显著高于其他组织 （P＜0.01）；脾脏和肾脏中的表达量极显著高于肝脏 （P＜0.01），脾脏中的表达量显著高于肾脏（P＜0.05）；精巢和心脏中的表达量极显著高于卵巢和脑 （P＜0.01）；在精巢和心脏，卵巢和脑之间的amh基因表达量无显著性差异 （P＞0.05）；其中amh基因在脾脏中的表达量最高，在脑中的表达量最低，精巢中的表达量大约是卵巢中的2倍。各组织的表达量依次为脾脏＞肾脏＞肝脏＞精巢＞心脏＞卵巢＞脑。

图1　红鳍东方鲀amh基因的表达谱Fig.1 The amh gene expression profile of redfin puffer Takifugu rubripes

2.6 红鳍东方鲀amh基因不同发育时期的表达

红鳍东方鲀amh基因不同发育时期的表达情况如图2所示。雌性红鳍东方鲀amh基因在各个发育时期的表达情况为：80日龄和30日龄幼鱼amh基因的表达量最多，与其他时期相比存在显著性差异 （P＜0.05）；2龄鱼中amh基因的表达量最低，且显著低于3龄成鱼 （P＜0.05）；80日龄和30日龄幼鱼，40日龄和60日龄幼鱼间的表达量均无显著性差异 （P＞0.05）；在不同发育时期中，23～30日龄amh基因的表达量呈增长趋势，40日龄时表达量降低，80日龄时有所升高，2龄时表达量最低，3龄时又有所升高。

图2　红鳍东方鲀amh基因在发育过程中的表达Fig.2 Ontogeny expression of amh gene in redfin puffer Takifugu rubripes

雄性个体amh基因在各个发育时期的表达情况为：除amh基因在40日龄和3龄时的表达量无显著性差异 （P＞0.05）外，其他各个发育时期间amh基因的表达量都存在显著性差异 （P＜0.05）；30日龄幼鱼的表达量最高，2龄鱼的表达量最低，23～30日龄时amh基因的表达量升高并达到最大值，到2龄期间呈现降低的趋势并达到最低值，3龄时又有所回升。23日龄、30日龄、2龄和3龄雄鱼amh基因的表达量极显著高于同期雌鱼 （P＜0.01），而60、80日龄时，amh基因在雌鱼中的表达量则极显著或显著高于雄鱼 （P＜0.01或P＜ 0.05），40日龄时雌、雄鱼的表达量无显著性差异（P＞0.05）。

3　讨论

3.1amh基因的组织表达

自1953年Jost用胚胎学方法发现AMH的存在开始，人们就一直在探索研究各个物种中AMH的结构和作用，关于amh基因的表达研究也在同步进行。Wang等［22］利用RT-PCR技术在斑马鱼成鱼的脑、精巢、卵巢、肾脏、肝脏和心脏中，均能检测到amh基因的表达。Halm等［23］用Southern blot对欧洲鲈鱼幼苗和成体的RT-PCR产物进行检测时发现，在脑、垂体、精巢、卵巢和心脏中amh基因也有表达。李蒙［24］通过qRT-PCR技术发现，amh基因在彭泽鲫成鱼的脑、肾脏、肝脏、肌肉、脾脏和卵巢中同样都有表达。本试验中，利用实时定量PCR技术研究了amh基因在红鳍东方鲀成鱼的肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等组织中的表达模式，得到了与上述相类似的结果，即amh基因在不同组织中均有不同程度的表达。

豆晓飞［25］通过RT-PCR技术对泥鳅和大鳞副泥鳅的心、肝脏、脑、肾脏、精巢和卵巢6个组织进行研究。结果发现：amh基因在两种泥鳅的各个组织中均有不同程度的表达，泥鳅中以卵巢中表达量最高，脑、心和精巢中也有着较多的表达，肝、肾中的表达较弱；而在大鳞副泥鳅各个组织中，心脏中的表达量最高，精巢、卵巢和肝脏中表达较多，脑中的表达较弱。刘姗姗等［26］研究发现，amh基因在半滑舌鳎雄鱼和伪雄鱼性腺中的表达量最高，卵巢、血液、皮肤和脑中次之，而在脾脏、心脏、肾脏、肝脏和垂体中表达量非常低。唐永凯等［27］研究发现，amh基因在奥利罗非鱼脑、肝脏、肌肉和心脏中未表达，只在精巢和卵巢中表达，并表现出性腺特异性表达。沈北岸［28］通过RT-PCR方法研究了amh基因在黄鳝脑、垂体、精巢、卵巢、肌肉、脾脏、心脏、肝脏、脾脏等组织中的表达情况，发现黄鳝也同样有性腺特异性表达，即只在精巢和卵巢中表达。而本试验中发现，amh基因在红鳍东方鲀脾脏中表达量最高，肾脏、肝脏、精巢和心脏中表达量也较多，但是卵巢和脑中表达量较少。由此可知，amh基因在不同物种中的组织表达模式存在差异，这可能与amh基因在不同物种中所起的作用不同有关。

哺乳动物雄性个体胚胎期睾丸产生的AMH能引起苗勒氏管退化，而雌性胚胎因为不产生AMH，苗勒氏管能够继续分化成为雌性生殖器官。对于硬骨鱼 （除鲟鱼外）而言，体内虽然没有苗勒氏管，但是在性腺和其他组织的体细胞中仍然能检测到amh基因的表达，这说明amh基因可能与硬骨鱼的器官发育和性别分化等过程相关。通过qRTPCR技术研究红鳍东方鲀中amh基因的组织表达模式，发现amh基因不存在性腺特异性表达，而是在各组织中广泛性表达，可能参与不同组织的发育调控。

3.2amh基因在不同发育时期的表达

Rashid等［29］、周贺等［30］、范文涛［31］等利用组织切片技术对红鳍东方鲀幼鱼的性腺观察发现：出生后35～40日龄时雌性幼鱼处于卵巢腔形成阶段，该阶段是卵巢分化的关键时期；出生后55～70日龄时雄性幼鱼处于精巢分化的关键时期——输精管原基形成阶段。以此为参照，本试验中分别取孵化后23、30、40、60、80日龄的红鳍东方鲀幼鱼作为研究对象。Kamiya等［32］研究发现，红鳍东方鲀AMHRⅡ激酶结构域中存在一对错义突变形成的等位基因，雌性个体中该等位基因是纯合子 （C/C），而雄性个体中的则是杂合子 （C/G）。本试验中，根据AMHRⅡ这个特异的多态性位点设计引物，PCR扩增片段包含此错义突变位点，将扩增得到的基因片段进行测序，根据该错义突变位点的多样性确定各个幼鱼的遗传性别。

应用qRT-PCR检测红鳍东方鲀幼鱼个体不同发育时期 （23、30、40、60、80日龄、2龄和3龄）amh基因的表达情况，根据各时期雌、雄鱼amh基因的表达量对比发现：雄鱼23日龄、30日龄、2龄和3龄鱼amh基因的表达量极显著高于同时期雌鱼；而在60和80日龄时雌鱼表达量却显著高于雄鱼；40日龄时雌、雄鱼的表达量无显著性差异。雄性个体amh的表达量从23～30日龄呈增长趋势，30日龄达到峰值，随后表达量逐渐降低；而雌鱼整体也呈现先增长后降低的趋势，80日龄时雌鱼amh基因表达量最高。这与刘姗姗等［26］发现的半滑舌鳎胚胎后不同发育时期amh基因的表达模式相类似，由于红鳍东方鲀和半滑舌鳎的发育周期不同，造成其最高表达量的出现时间也不一致。amh基因在30日龄雄性红鳍东方鲀幼鱼中表达量最高，而此时的雌性个体中表达量相对较低；60日龄时雌性幼鱼的表达量极显著高于雄鱼，这两个时期与Rashid等［29］发现的红鳍东方鲀性别分化时期正好吻合。在红鳍东方鲀性别分化的关键时期，amh基因在精巢和卵巢中的表达量具有显著性差异，这表明amh基因参与了红鳍东方鲀的性别分化过程。

在对哺乳动物的研究中，amh基因缺失的小鼠表现为假两性症状，XY型小鼠拥有正常生殖系统的同时还拥有子宫和输卵管；精巢能够正常发育且能产生正常精子，但后代却是不育的，可能是这些雄性个体发育过程中雌性生殖器官对正常受精过程产生干扰。因此，amh基因对保证雄性个体的可育及雌性个体正常生殖器官的形成是非常重要的，AMH可以通过自分泌或旁分泌的方式来调节精巢中生殖细胞的增殖［33］。另有研究发现，银汉鱼Odontesthes hatcheri中一个位于雄性特有的Y染色体上的复制体 （amhy）可能是性别决定的关键因素，敲除amhy基因将会造成遗传性雄性个体卵巢的发育［34］。Rodríguez-Marí等［11］利用qRT-PCR技术对斑马鱼的amh基因研究发现，在未分化的性腺中就有微弱的表达了，在性腺已经分化的雌、雄幼鱼中其表达情况不同，显示出了两性表达模式，只在精巢中表达，可见amh基因参与了斑马鱼精巢的发育和生殖细胞的增殖过程。赵静［35］利用RNA反义探针原位杂交技术，发现amh基因在黄鳝卵巢滤泡细胞的颗粒细胞中和成熟精巢的支持细胞中表达，这表明amh基因在黄鳝性腺发育过程中起到一定的作用。Miura等［36］和 Yoshinaga等［9］通过原位杂交技术分别在日本鳗鲡和日本比目鱼的睾丸支持细胞中检测到amh基因的表达，但是在卵巢中却未检测到。amh基因通过在日本鳗鲡未成熟精巢的睾丸支持细胞中表达，来阻止精子发生的启动。但是，Shiraishi等［37］利用相同的方法研究却发现，青鳉amh基因在两性性腺生殖细胞周围的体细胞中均有表达，没有表现出性别二态型。通过使用5-溴-2′-脱氧尿嘧啶标签分析生殖细胞的增殖情况发现，在早期性腺分化过程中，生殖细胞的增殖需要AMH的参与，AMH功能的缺失能使生殖细胞的增殖受到抑制［37］。

不同物种amh基因的表达模式存在很大差别，说明amh基因在鱼类中的表达及其功能存在差异性。与青鳉类似，红鳍东方鲀中amh基因在不同发育时期并没有表现出二态型表达，从23～40日龄期间精巢中表达量高，80日龄时卵巢中的表达量高于精巢，成鱼时精巢中的表达量再次升高，性腺发育成熟的雌、雄3龄鱼中amh基因的表达量均极显著高于2龄鱼，并且这两个时期雄鱼中amh基因的表达量均显著高于雌性。因此，amh基因在红鳍东方鲀的性腺发育和生殖细胞增殖过程中也可能发挥着一定的作用。当然这只是基于一种推测，其真正的机理还有待进一步探究，例如可以研究AMH的受体基因 amhrⅡ。Rashid等［29］就发现，amh基因在青鳉性腺生殖细胞周围的体细胞中表达后，能通过amhrⅡ基因间接地刺激生殖细胞增殖。红鳍东方鲀中是否也会存在相似的功能机理，将在后续试验中进一步探究。

4　结论

本研究中，利用qRT-PCR对amh基因在红鳍东方鲀成鱼不同组织中和幼鱼不同发育阶段的表达进行了初步分析，结果表明：红鳍东方鲀amh基因在脾脏中的表达量最高，其次是肾脏、肝脏、精巢和心脏，在卵巢和脑中的表达量较低，且精巢中的表达量大约是卵巢的2倍；23日龄、30日龄、2龄和3龄红鳍东方鲀雄鱼amh基因的表达量极显著高于同期雌鱼 （P＜0.01），60日龄和80日龄时雌鱼表达量则极显著和显著高于雄鱼 （P＜0.01和P＜0.05），40日龄时雌、雄鱼的表达量无显著性差异 （P＞0.05）；在雄性红鳍东方鲀不同发育时期中，23～30日龄时amh基因的表达量升高并达到最大值，80日龄～2龄期间呈现降低的趋势并达到最低值，3龄时又有所回升；雌鱼整体呈现先增长后降低的趋势，80日龄时雌鱼amh基因表达量最高。

由此可以推测，amh基因在红鳍东方鲀性别分化和性腺发育以及生殖细胞的增殖过程中发挥着一定的作用。

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高长富1，郝薇薇1，仇雪梅1，孔德荣1，孟雪松2，包玉龙2，王秀利1
（1.大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室，辽宁大连116023；2.大连天正实业有限公司，辽宁大连116011）

Expression of anti-Müllerian hormone（AMH）gene in different tissues and developmental phases in redfin puffer Takifugu rubripes

GAO Chang-fu1，HAO Wei-wei1，QIU Xue-mei1，KONG De-rong1，MENG Xue-song2，BAO Yu-long2，WANG Xiu-li1
（1.Key Laboratory of Mariculture&Stock Enhancement in North China's Sea，Ministry of Agriculture，Dalian Ocean University，Dalian 116023，China；2.Dalian Tianzheng Industrial Corporation Limited，Dalian 116011，China）

In this study，expressions of anti-Müllerian hormone（AMH）in kidney，brain，heart，spleen，liver，testis and ovary were investigated in different developmental stages in redfin puffer Takifugu rubripes including 23，30，40，60，and 80 days old，and 2，and 3 years old individuals by fluorescence quantitative Real-time Polymerase Chain Reaction（qRT-PCR）.The results showed that there was very significantly higher expression of amh gene in spleen，kidney and liver than that in other organs（P＜0.01），very significantly higher in testis than that in ovary and brain，the maximal in spleen，and the minimal in brain（P＜0.01）.There was very significantly higher expression level of amh gene in male redfin puffer with 23 and 30 days old，and 2 and 3 years old than that in female individuals（P＜0.01）.In the 60 days and 80 days old individuals，however，the female had significantly higher expression level of amh gene than the male did（P＜0.05）.No significant difference in expression level of amh gene was observed between males and females in 40 days old individuals（P＞0.05）.The 3 years old redfin puffer showed significantly higher expression of amh gene than the 2 years old one did（P＜0.05）.The amh gene expression level in males was increased from 23 days old to 30 days old，the maximal in the 30 days old indivduals，and then decreased in later stages，while the amh gene gene expression level in females was increased from 23 days old to 80 days old and subsequently was decreased in later stages.The findings indicate that amh gene may play an important role in gonadal development and sex differentiation in redfin puffer.

Takifugu rubripes；quantitative Real-Time PCR；AMH；gene expression

Q45

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2016.04.008

2095-1388（2016）04-0390-07

2015-10-26

大连市科技计划项目 （2014B11NC091）；大连海洋大学科研项目 （2012HYDX07）；国家海洋公益性行业科研专项（201405003）

高长富 （1990—），男，硕士研究生。E-mail：gaochf0227@163.com

仇雪梅 （1964—），女，博士，教授。E-mail：xmqiu@dlou.edu.cn