马卫敬，王慧岭，陈 昱，刘敏胜

(新奥科技发展有限公司，煤基低碳能源国家重点实验室，河北廊坊 065000)



角毛藻冷藏存储最长时间的探讨

马卫敬，王慧岭，陈 昱，刘敏胜*

(新奥科技发展有限公司，煤基低碳能源国家重点实验室，河北廊坊 065000)

采用离心后不同的低温保存方式和添加新鲜培养基的方法，对角毛藻离心收集后储存的最长时间进行了研究。结果表明，添加新鲜培养基的储存方法优于直接添加藻液的方法，并且存储时间长；角毛藻在3 000 r/min或较低转数离心后，藻泥可以添加新鲜培养基储存于-2 ℃冰箱，至少储存35 d，再培养不影响生长。角毛藻储存温度越低，储存时间就越长，但要在角毛藻不结冰的情况下。此保藏方法可以应用于角毛藻销售中转储存。

角毛藻；离心；储存；再培养

牟氏角毛藻(Chaetocerosmuelleri)为耐高温单细胞藻类，在正常情况下细胞长3.7～8.7 μm，宽2.9～8.3 μm，角毛长10.2～14.5 μm。色素体1个，呈黄褐色。细胞大多数单独生活，有时也由2～3个集合而成短的群体。在泥蚶和牡蛎等贝类育苗生产中，角毛藻作为鲍鱼、贝类等幼体的优质饵料，与其他单胞藻相比具有耐高温、繁殖速度快、抗污染能力强等优点[1]，深受水产养殖者的欢迎。梁妍等[2]研究离心和冷藏对牟氏角毛藻再培养的影响，发现4 ℃冷藏后的角毛藻常温下再培养效果较差。低温冷藏会影响藻细胞的正常生长，并且随着冷藏时间的延长，细胞再培养愈来愈困难。但是，在实际养殖生产中，若保存时间过短会使藻变质坏掉，最终导致资源浪费。笔者探讨了角毛藻冷藏存储的最长时间。

1　材料与方法

1.1试验材料试验所用角毛藻由新奥科技发展有限公司藻种库提供。试验藻种在跑道池中养殖，达到一定产量后进行收集。

1.2培养基配方角毛藻细胞培养所用培养基的配方参考文献[3]。

1.3仪器与药品

1.3.1仪器。冰箱(Electrolux)，型号BCD-271WFC；台式高速冷冻离心机，型号sigma3K15/1079；电子显微镜，型号Olympus CX31RTSF。

1.3.2药品。除微量元素为500 g/瓶的分析纯外，其他均为50 kg食品级营养盐。

1.4试验方法将培养的角毛藻4 000 r/min离心5 min后添加新鲜培养基，将获得的藻液与藻泥同时储存于4 ℃和-2 ℃冰箱中。冷冻储存23 d后，在光照强度100 μmol/(m2·s)下进行再培养。使用紫外分光光度计于波长750 nm处测定OD值。使用电子显微镜观察不同条件储存后的细胞形态。

2　结果与分析

不同存储条件下藻泥再培养情况的对比如图1所示。从图2可以看出，-2 ℃下藻泥细胞边缘模糊，细胞有破损(图2A)；-2 ℃下藻泥添加培养基冷冻的角毛藻细胞边缘清晰，细胞状态正常(图2B)。

注：A.接种前；B.培养3 d后。a.4 ℃下储存的藻泥；b.4 ℃下储存的藻液；c.-2 ℃储存下的藻泥；d.-2 ℃下储存的藻液。Note：A.Before inoculation；B.Culture for 3 d；a.Algae mud under -2 ℃；b.Algae liquid stored at 4 ℃；c.Algae mud under -2 ℃；d. Algae liquid stored at -2 ℃.图1　不同存储条件下藻泥再培养情况的对比Fig.1　Comparison of subculture situation of algae mud under different storage conditions

注：A.-2 ℃下储存的藻泥；B.-2 ℃下储存的藻液。Note：A.Algae mud under -2 ℃；B.Adding culture medium in algae mud and algae liquid stored at -2 ℃.图2　-2 ℃下储存的角毛藻细胞的镜检结果对比Fig.2　Comparison of algae cell microscopy under -2 ℃ storage condition

图3　4 ℃下培养不同时间藻泥和藻液的OD值对比Fig.3　Comparison of OD values of algae mud and liquid cultured at 4 ℃ for different time periods

由表1可知，在样品不同条件下储存23 d后进行再培养，发现4 ℃藻泥、4 ℃藻液、-2 ℃藻泥均死亡变臭，不能进行再培养。结合冷冻试验结果可知，离心后藻液在4 ℃下储存的时间约为15 d，20 d左右会出现异味，因此储存23 d再培养时就会影响藻体生长。但是，-2 ℃下储存23 d后的藻

注：A.接种前；B.接种后。Note：A.Before inoculation；B.After inoculation. 图4　角毛藻再培养生长情况的对比Fig.4　Comparison of growth situation of C.muelleri subculture

液再培养不受影响。 虽然管式离心后的藻泥浓度较高，但不可以直接在冰箱中储藏；离心后的藻泥可以添加少量的培养基储存于-2 ℃冰箱中，储存23 d也不影响藻品质，储存33 d后无异味，储存35 d后出现少量异味，但不影响生长；用几批收集后直接出售的藻液在4 ℃冰箱中储存6 d就已变臭，这是因为藻泥用藻液稀释，并且在第6天镜检时发现有活跃的原生动物，所以建议收集后的藻泥用藻稀释，这样会延长储存时间。角毛藻只要不结冰，取出正常培养就不受影响。

表1　不同储存条件下藻泥的再培养情况

3　结论

(1)角毛藻在一定转数离心后，藻泥添加养殖的藻液在4 ℃下储存2～3 d后出现异味。离心后的藻泥添加新鲜培养基后，储存时间变长，-2 ℃下可以储存35 d。原藻液中含有原生动物等容易变质，离心后的藻泥因为细菌数量减少变得不易引起变质，添加的新鲜培养基中原生动物较少，故在低温下保存时间较长。

(2)-2 ℃为介于-4～4℃之间，不易结冰，基本符合储

存要求。角毛藻在不结冰的低温条件下储存后，基本不影响生长。

(3)此储存方法可以应用于角毛藻销售中转储存。

[1] 郑忠明，金春华，冯坚.牟氏角毛藻的生产性培养技术[J].水产科学，2002,21(6)：20-21.

[2] 梁妍，邹宁，潘曰磊，等.离心·冷藏对牟氏角毛藻再培养的影响[J].安徽农业科学，2008，36(33)：14459-14460，144624.

[3] 邹宁，李艳，孙东红.几种有经济价值的微藻及其应用[J].烟台师范学院学报，2005，21(1)：59-63.

Discussion on the Longest Storage Time ofChaetocerosmuelleriunder Refrigeration Condition

MA Wei-jing, WANG Hui-ling, CHEN Yu, LIU Min-sheng*

(ENN Science and Technology Development Co., Ltd., State Key Laboratory of Coal Based Low Carbon Energy, Langfang, Hebei 065000)

After centrifugation, different low-temperature storage method and the method of adding fresh culture medium were applied to research the longest storage time ofChaetocerosmuelleri. Results showed that the storage method of adding fresh culture medium was superior to directly adding algae liquid. After algal biomass was centrifuged at speed of 3 000 r/min or lower speed, fresh medium was added into the sludge and stored at -2 ℃ in refrigerator for at least 35 d. Subculture did not affect the growth. The lower storage temperature ofC.muellerimade longer storage time under the condition of non-freezing. This storage method could be used for transitional storage in the sale ofC.muelleri.

Chaetocerosmuelleri;Centrifugation; Storage; Subculture

马卫敬(1983- )，女，河北邯郸人，助理工程师，从事微藻养殖与光反应器制造等方面的研究。*通讯作者，副研究员，从事微藻高效养殖和微藻规模化养殖研究。

2016-05-20

S 984.4

A

0517-6611(2016)18-144-02