沙棘品种深秋红茎尖组织培养

2016-09-24张西珍韩晓燕牛建新

安徽农业科学 2016年18期

霍川，赵英，3*，张西珍，韩晓燕，牛建新，4*

(1.石河子大学农学院园艺系，新疆石河子 832003；2.阿勒泰小浆果研究中心，新疆阿勒泰 836500； 3.新疆林业厅林果办，新疆乌鲁木齐 830000； 4.特色果蔬栽培生理与种质资源利用兵团重点实验室，新疆石河子 832003)

沙棘品种深秋红茎尖组织培养

霍川1，2，赵英1，2，3*，张西珍1，2，韩晓燕2，牛建新1，2，4*

[目的]筛选沙棘品种深秋红茎尖组织培养基配方。[方法]选用不同培养基，以7月中旬至8月下旬采集的大田茎尖为外植体，对沙棘品种深秋红的组织培养技术进行研究。[结果]最适初代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L，最适愈伤组织诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 0.5 mg/L，最适继代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 0.2 mg/L，最适腋芽诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L。[结论]该研究建立了沙棘品种深秋红茎尖组织培养技术，为其产业化生产奠定基础。

沙棘；茎尖；组织培养

沙棘(HippophaerhamnoidesL.)为胡颓子科(Elaeagnaceae)沙棘属(HippophaeL.)落叶灌木或小乔木，根系发达，枝叶茂密，适应能力极强，抗严寒，抗风沙耐干旱，是土壤贫瘠和沙漠化地区水土保持的先锋树种。沙棘主要生长在干旱、半干旱地区，抗逆能力强，有广泛的适应性，我国西北、华北、东北、西南各省均有分布，是一种集社会效益、生态效益、经济效益于一身的珍贵树种。近年来，沙棘以其独有的经济和生态上的双重优势越来越受到广泛关注，逐渐成为我国山区的一种宝贵植物资源。

随着西部大开发步伐的加快，山区绿化、生态农业建设急需大量的沙棘苗木，传统的分株繁殖、幼枝扦插繁殖已无法满足需要，而组织培养育苗由于不受季节和地域限制，既能达到快速繁育的目的，又能很好地保持良种特性的优势，尤其可对雌雄异株的沙棘做定性繁育，具有很大的发展前景。沙棘组织培养研究已有相关报道[1-6]，但尚无可用于产业化生产的报道及配方。笔者以阿勒泰地区重点发展品种之一深秋红为试验材料，对其组织培养配方进行筛选，为今后产业化生产奠定基础。

1　材料与方法

1.1试验材料供试材料于2015年7月中旬至8月下旬采于阿勒泰市沙棘庄园，取成年植株当年生枝条的茎尖为外植体。

1.2试验方法

1.2.1初代培养。以茎尖为试材，先用自来水冲洗，再用洗洁精浸泡10 min，期间不断搅拌，然后用流动自来水清洗15 min，蒸馏水冲洗3遍，之后装入消毒烧杯中立即置于超净工作台上，用0.1% HgCl2消毒3 min，期间不断振摇，最后用灭菌蒸馏水冲洗6次。将茎尖放在灭菌的滤纸上将水分吸干，切成0.5～1.5 cm长，将茎尖基部叶片剥离，接种于初代培养基上，每瓶接种3个茎尖。初代培养基分别以1/2MS和1/3MS为基本培养基，添加不同浓度的6-BA、IBA和NAA。初始培养基设计10个处理：①1/2MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L；②1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L；③1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；④1/3MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；⑤1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L；⑥1/2MS+6-BA 0.5 mg/L；⑦1/2MS+6-BA 0.2 mg/L；⑧1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L；⑨1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.05 mg/L；⑩1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.02 mg/L。

1.2.2继代培养。

1.2.2.1茎尖基部愈伤组织诱导。诱导愈伤组织时，将高于2 cm的初代芽接种至以1/2MS和1/3MS为基本培养基的继代培养基上，添加不同浓度的6-BA和IBA。愈伤组织诱导培养基设计4个处理：①1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L；②1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L；③1/3MS+6-BA 0.2 mg/L+IBA 0.2 mg/L；④1/2MS+6-BA 0.3 mg/L+IBA 0.05 mg/L。

1.2.2.2增殖培养。将初代无菌苗切下，再将茎尖和带有2～3片叶的茎段切分，茎尖接种至1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L继代培养基上，带腋芽的茎段接种至1/2MS+6-BA 0.5 mg/L继代培养基上。

1.3培养条件蔗糖30 g/L，琼脂6 g/L，每瓶分装培养基25～35 mL，pH 5.6～6.0，培养室温度20～26 ℃，湿度40%～60%，光照强度2 000 lx，光照时间12～14 h/d 。

2　结果与分析

2.1初代培养的建立由表1可知，沙棘初代茎尖在培养基⑥和⑦上长势最好。在培养基①、②、⑤、⑧上萌发率低或生长较慢，其他培养基长势一般。6-BA浓度在0.2～0.5 mg/L未添加任何生长素时，对于7月中旬至8月下旬的茎尖有较好的侧芽诱导效果，生长快，分化芽数最多。当6-BA浓度在0.5 mg/L时，添加不同浓度的生长素IBA，结果表明，浓度低于0.2 mg/L时生长迅速，但后期易死亡，浓度达0.5 mg/L时，基部愈伤组织开始形成。而6-BA与NAA的组合则不适合深秋红初代培养。其中，培养基⑥即1/2MS+6-BA 0.5 mg/L成活率可达92.3%，平均分化芽数可达2.53，为适宜初代培养基(图1)。

表1　不同培养基配方对初代培养的影响

图1　初代茎尖组织培养Fig.1　Primary stem tip tissue culture

2.2愈伤组织的诱导将初代培养萌发的2～3 cm的侧芽无菌苗切下，转入继代培养基中，成功诱导出愈伤组织。适合诱导愈伤组织的培养基是1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，诱导率达100%。在此培养基上，无菌苗生长迅速，15 d左右根部切口部位开始膨大，愈伤组织为黄绿色，继续培养至30 d左右时，茎尖生长缓慢或停止，根部愈伤组织明显增大，直径可达1.5 cm左右，当培养至40 d左右时，愈伤组织变深褐色失去活力甚至开始死亡。而在培养基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L上愈伤组织诱导率为66.3%，愈伤组织块较培养基1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L的体积小，30 d时直径约1 cm，继续培养至40 d以上时，由愈伤组织萌发出少量芽，但愈伤组织转黑褐色，萌发的芽有玻璃化现象，无法正常生长(表2、图2)。

2.3继代培养将初代形成的株高3 cm以上的无菌苗截成带腋芽茎段诱导增殖，转移至新的培养基上进行继代培养，经20 d左右培养后，当新芽高2 cm以上时，再切分成小段转接诱导增殖以达到扩繁的目的。茎尖在1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L上长势迅速，茎段在1/2MS+6-BA 0.5 mg/L上诱导腋芽萌发生长效果较好。但腋芽增殖系数较低，平均诱导腋芽数也少，难以满足快繁的要求(表3、图3、4)。

表2　不同培养基配方对愈伤组织诱导的影响

图2　沙棘苗根部诱导的愈伤组织Fig.2　Callus induced by seabuckthorn roots

表3　沙棘品种深秋红继代培养效果

图3　继代茎尖组织培养Fig.3　Subculture of stem tip

图4　继代茎段诱导腋芽萌发Fig.4　Axillary buds germination induced by subculture of stem tip

3　结论与讨论

该研究以7月中旬至8月下旬采集的大田茎尖为外植体，对沙棘品种深秋红组织培养进行研究。结果表明，适宜初代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L，适宜愈伤组织诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.5 mg/L，适宜继代培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L+IBA 0.2 mg/L，适宜腋芽诱导培养基为1/2MS+6-BA 0.5 mg/L。

在初代培养时，单一使用细胞分裂素效果优于细胞分裂素和细胞生长素配合使用，其原因可能是此阶段的内源生长素含量较高。在诱导腋芽时发现，通常一个叶腋着生一个腋芽，但繁殖系数偏低，原因可能是尚未筛选出最适的培养基配方。

褐化是沙棘组织培养中常见的问题，其创伤分泌出的酚类物质一旦接触空气便被氧化成醌类有毒物质，这些有毒物质积累在培养基中而使培养材料死亡[7]。在木本植物组织培养过程中，褐变受培养温度、外植体、激素浓度、光照等因素的影响[8～10]。在该试验中，外植体接种前进行低温处理，即将冲洗过后的外植体密封置于4～6 ℃环境中3～5 h后接种，褐化现象受到一定程度的抑制，原因是低温使外植体代谢速度减缓，减少了醌类物质的形成[11]。

通过对沙棘品种深秋红进行组织培养试验，发现不同树龄、部位等的植株间外植体的差异对生长增殖影响较大。该试验虽已获得初步成功，但尚未达到快速繁殖及工厂化生产的目的，尚有许多问题有待进一步研究。

[1] 孙兰英，单金友，王春艳，等.沙棘组织培养基筛选试验[J].沙棘，1998，11(3)：14-16.

[2] 徐虹，王俊峰，梁宗锁.沙棘组织培养技术研究现状及存在问题[J].沙棘，1999，12(1)：11-13.

[3] 李师翁，范小峰.大果良种沙棘愈伤组织诱导及植株再生的研究[J].西北植物学报，2001，21(2)：262-266.

[4] 徐虹，梁宗锁.沙棘组织培养技术的研究[J].西北植物学报，2001，21(2)：267-272.

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[7] 杜研，李毅，马彦军，等.几种影响沙棘组织培养外植体褐化因子分析[J].河北农业大学学报，2007，30(5)：40-43.

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Tissue Culture of Stem Tip of Seabuckthorn Variety Shenqiuhong

HUO Chuan1, 2, ZHAO Ying1, 2, 3*, ZHANG Xi-zheng1, 2, NIU Jian-xin1, 2, 4*et al

(1. Department of Horticulture, College of Agriculture, Shihezi University, Shihezi, Xinjiang 832003; 2. Altay Berries Research Center, Ataile，Xinjiang 836500; 3. Fruit Office of Xinjiang Forestry Department, Urumqi, Xinjiang 830000; 4. Xinjiang Production and Construction Corps Key Laboratory of Special Fruits and Vegetables Cultivation Physiology and Germplasm Resources Utilization, Shihezi, Xinjiang 832003)

[Objective] The aim was to screen out culture medium formula for stem tip of seabuckthorn variety Shenqiuhong. [Method] By using different culture mediums, with stem tip collected from middle Jul. to late Aug. as explants, tissue culture technology of seabuckthorn variety Shenqiuhong was studied. [Result] The optimal primary culture medium was 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L, the optimal callus induction culture medium was 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 0.5 mg/L, the optimal subculture medium was 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L +IBA 0.2 mg/L, the appropriate axillary bud induction medium was 1/2MS+6-BA 0.5 mg/L. [Conclusion] The cultivation technique for stem tip of seabuckthorn variety Shenqiuhong is established, which will lay a foundation for industrialized production.

Seabuckthorn; Stem tip; Tissue culture

中央财政林业科技推广示范项目(ZYLYKJTG2015014)。

霍川(1992- )，男，河南太康人，硕士研究生，研究方向：沙棘组织培养。*通讯作者，赵英，高级工程师，博士，硕士生导师，从事沙棘良种选育和开发利用研究；*通讯作者，牛建新，教授，博士，博士生导师，从事果树与生物技术研究。

2016-05-26

S 723.1

0517-6611(2016)18-127-03