林永敏,任广立,张卫云,蔡启茵,谢　聪,马恒颢

(南方医科大学附属广州军区广州总医院：1.儿科；2.检验科,广州 510010)



论著·基础研究

人microRNA-21真核过表达载体的构建及其在HepG2.2.15细胞中上调c-myc基因的表达*

林永敏1,任广立1,张卫云2,蔡启茵1,谢聪1,马恒颢1

(南方医科大学附属广州军区广州总医院：1.儿科；2.检验科,广州 510010)

目的构建人微小RNA-21(microRNA-21,miRNA-21)真核过表达载体pmR-21,探讨其在HepG2.2.15细胞中对c-myc基因表达的调控作用。方法PCR扩增miRNA-21的前体基因片段(pre-miRNA-21),双酶切后连接到pmR-mCherry载体上,通过双酶切和测序验证重组载体的准确性；将重组载体转染到HepG2.2.15细胞中为实验组，另设空载体组(转染pmR-mCherry空质粒组)，空白组(未转染组)，阳性对照组(HepG2细胞),24 h后观察载体荧光蛋白表达情况,流式细胞术检测转染效率,实时荧光定量PCR评估miRNA-21的表达情况；转染72 h后,RT-PCR和Western blot检测c-myc mRNA及蛋白表达水平；CCK-8法检测各组细胞增殖情况。结果经双酶切和测序验证,目的基因片段插入载体中；实验组及空载体组转染24 h后细胞内可见强荧光,转染效率大于50%；实验组细胞miRNA-21表达较空载体组、空白组水平升高；转染72 h后实验组细胞c-myc mRNA表达较空载体组、空白组升高；实验组细胞增殖快于空载体组及空白组，差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功构建miRNA-21真核过表达载体pmR-21,该重组载体可稳定表达miRNA-21；miRNA-21可上调c-myc基因的表达,c-myc基因是miRNA-21发挥促癌作用的靶点之一。

微RNA-21;遗传载体;基因,c-myc;乙型肝炎相关性肝肿瘤;HepG2.2.15细胞

微小RNA(microRNA，miRNA)是一类长度约22 nt的内源性非编码RNA,可以在转录后期作用于特定的mRNA,调控基因的表达。miRNA除了参与正常的生理过程外,还在感染、肿瘤发生发展、心脑血管疾病等方面发挥重要的作用[1],为相关疾病的诊治提供新的突破点。……