猪巴氏杆菌病的病原分离鉴定及药敏试验

2016-09-20时永强祝宇王奇惠张赛飞曲伟杰

中兽医学杂志 2016年4期

关键词：氏杆菌琼脂氧氟沙星

时永强，祝宇，王奇惠，张赛飞，曲伟杰

（云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201）

猪巴氏杆菌病的病原分离鉴定及药敏试验

时永强，祝宇，王奇惠，张赛飞，曲伟杰

（云南农业大学动物科学技术学院，云南昆明650201）

为了及时鉴定猪巴氏杆菌病，对疾病做出准确额治疗。本实验通过细菌分离、生化试验、动物试验、药敏试验等方法对规模化养猪场的三例疑似巴氏杆菌病例猪进行病原菌分离鉴定、药敏试验等系列检测。结果显示，从三例疑似巴氏杆菌病例猪中均分离到了巴氏杆菌；三例猪巴氏杆菌病例的高敏药物分别是：左氧氟沙星、头孢哌酮、左氧氟沙星。本实验成功分离了巴氏杆菌并对其进行了药敏试验，对猪巴氏杆菌病的准确诊断以及治疗提供一定的理论依据。

猪巴氏杆菌；分离鉴定；药敏试验

猪巴氏杆菌病（Swinepasteurellosis）是由多杀性巴氏杆菌引起的急性流行性或散发性和继发性传染病。多杀性巴氏杆菌为细小的球杆状或短杆状菌，两端钝圆，近似椭圆形，在培养物中呈圆形、卵圆形或杆状，单在，有时成双排列，病料涂片用瑞氏染色或美兰染色时，可见明显的两极着色。新分离的强毒菌株具有粘液性荚膜，但经培养后迅速消失。本菌无芽胞，无鞭毛。革兰氏染色阴性。阳光直射下数分钟死亡，高温立即死亡，一般消毒液均能杀死［1］。

本菌为条件病原菌，常存在于健康猪的呼吸道，与宿主呈共栖状态。当猪饲养在不卫生的环境中，由于感受风寒、饥饿等因素使机体抵抗力降低时，该菌乘虚侵入体内，经淋巴液入血液引起败血症。该病主要经消化道感染，其次通过飞沫经呼吸道感染，亦有经皮肤伤口或蚊蝇叮咬而感染的。该病常年可发生，在气温变化大、阴湿寒冷时更易发病；常呈散发性或地方流行性发生［2］。

在本病的防治过程中常采用的方法免疫接种和抗菌药物。通过药敏试验可以筛选出高敏的药物，如左氧氟沙星，头孢哌酮［3］。但抗菌药物的大量使用，巴氏杆菌的耐药率大幅度上升，多重耐药菌株剧增，耐药谱增宽，由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会发生基因突变突破种间障碍进而对人类健康也造成潜在威胁。因此，临床上应合理应用抗菌药物，以避免或减少耐药性的产生，而合理应用抗菌药物控制畜禽疾病的一项重要内容就是通过药敏试验指导临床用药，以充分发挥抗菌药物疗效，并尽可能减少其不良影响。

通过分析现阶段猪致病性巴氏杆菌的分离鉴定以及药敏试验，一是有利于规模化养猪场巴氏杆菌病的防治，减少因巴氏杆菌菌病导致的经济损失，二是防止耐药菌株的出现，正确指导临床科学用药，力求针对性用药，防止盲目用药。

1　材料与方法

1.1主要仪器

电恒温培养箱（购于上海一恒科学仪器有限公司）、超净工作台（购于苏州工业园区华都净化空调技术有限公司）、高压灭菌器（购于上海博迅实业有限公司公司）、冰箱（购于昆明塔洛制冷技术有限公司）、离心机（购于湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、移液枪、接种环、塑料培养皿购于常用玻璃器械等。

1.2主要试剂及药品

1.2.1培养基

血清琼脂、血清肉糖、1%蛋白胨水、葡萄糖蛋白胨水、普通培养基、鲜血琼脂培养基脱纤维绵羊血购于昆明锦昂科技有限公司；细菌生化鉴定管购于杭州滨和生物有限公司。

1.2.2药敏试纸

哌拉西林、头孢哌酮、头孢噻肟、头孢唑林、阿米卡星、四环素、氨苄西林、磺胺、庆大霉素、氯霉素、左氧氟沙星、头孢他啶（购于浙江滨和微生物试剂有限公司）。

1.3病例来源

取自规模化猪场：分别记为病例一、病例二、病例三，发病病例经流行情况调查、症状检查进行初步诊断。

1.4方法

1.4.1临床症状观察及剖检

通过对猪只表现的临床症状进行观察并记录，同时对猪只进行剖检，观察期组织器官病理变化。

1.4.2病原菌分离培养及纯化培养

无菌操作，解剖病猪，将疑似为猪巴氏杆菌病的病料如心血、肝、脾在超净台上用烧红的刀片烧烙灭菌肝、脾病变区和正常区交界处表面，然后用该刀片在烧烙部位的表面切开一小口，用接种环深入挑取少量病料组织分别接种于普通琼脂培养基，置37℃温箱中培养24～48h，进行细菌分离培养。

然后以无菌操作挑取单个灰白色、圆形的典型菌落接种于鲜血琼脂平板上分区划线进行纯培养，倒置放于37℃培养24-28h后，将平板放置于4℃冰箱中备用。

1.4.3分离菌的形态学观察

取5%猪鲜血琼脂平板中的单个菌落涂片，进行革兰氏染色和瑞士染色。

革兰氏染色过程：（1）在已干燥固定（火焰固定）好的抹片上，滴加草酸铵结晶紫溶液，经1-2分钟，水洗。（2）加革兰氏碘溶液于抹片上媒染，作用1-3分钟，水洗。（3）加95%酒精于抹片上脱色，约0.5-1分钟，水洗。（4）加稀释的沙黄水溶液复染10-30秒，水洗。（5）自然干燥。

瑞士染色过程：（1）取病料涂片、自然干燥（2）滴加瑞氏染液染3分钟，使标本被其中甲醛所固定；（3）加等量PH6.4的磷酸盐缓冲液（或等量超纯水）轻轻晃动玻片，均匀静置5分钟；（4）水洗、吸干、镜检。

镜检：油镜下检查菌体形态染色特点，对分离菌进行初步鉴定［4］。

1.4.4生化鉴定

分别勾取分离菌纯培养物无菌接种于上述各种生化试验培养基中，37℃培养24-48h后判定结果。

1.4.5药敏试验

对3起猪巴氏杆菌病例进行了纸片法药敏试验［6］。具体过程如下：（1）取无菌的平皿于超净工作台（2）取高压灭菌的生理盐水5mL与1-2个菌落混合制成菌液，将菌液倒入平皿，使覆盖培养基表面，菌液涂布整个培养基表面后再倒出；（3）按画好的标记贴上药敏试纸；（4）放入37℃、24h培养。

1.4.6动物回归性试验

将昆明小鼠随机分为四组，分别为标为A、B、C、D。其中ABC三组为实验组，D为对照组，实验组分别注射0.5ml的分离菌液，D组则注射相同的生理盐水，观察其临床症状。

2　结果

2.1临场症状及病理变化

病猪体温升高到41℃以上，精神差，食欲减少或废绝，初为干性短咳，后变湿性痛咳，鼻孔流出浆性或脓性分泌物，触诊胸壁有疼痛感，听诊有啰音或摩擦音，呼吸困难，张口吐舌［5］。剖检可见，肺小叶间质水肿、增宽，有不同发展时期的肝变区，病变部质度坚实如肝，切面有暗红、灰红、灰白或灰黄等不同色彩，呈大理石样外观。支气管内充满分泌物。胸腔和心包内积有多量淡红色混浊液体，内混有纤维素。胸膜和心包膜粗糙无光泽，上附纤维素，甚至心包和胸膜或者肺与胸膜发生粘连。胸部淋巴结肿大或出血。

2.2病原菌分离培养及纯化培养

将病料培养18h-24h后，分离菌在鲜血琼脂平板上形成灰白色圆形微隆起、半透明、湿润、表面光滑、边缘整齐的丰盛的露珠样菌落，不溶血［7］。

2.3分离菌的形态学检查

革兰氏染色镜检可见到革兰氏阴性两端钝圆、以单个或成双排列形态均匀一致的小杆菌；瑞士染色镜检，观察到大量两极浓染的小杆菌［8］。

2.4生化试验

对分离到的3株致病菌分别进行了生化试验，结果符合猪巴氏杆菌的特征。见表1。

2.5药敏试验

由表2可知各实验组的高敏药物分别为：病例一为左氧氟沙星；病例二为头孢哌酮；病例三为左氧氟沙星。

表1　生化实验结果

2.6动物回归试验结果

实验组的小鼠死亡，而对照组的小鼠依然存活，将实验组的小鼠剖检，去病料用接种环挑取少量病理组织接种到鲜血培养基中，经过染色镜检以及生化试验成功分离到巴氏杆菌。

表2　巴氏杆菌药敏试验结果　单位：mm

3　讨论

3.1本次实验所分离的巴氏杆菌生长出直径1～2 mm，圆形，光滑，半透明，湿润的菌落，在鲜血琼脂平板上无溶血现象，在普通平板上生长贫瘠，形成细小的菌落，在麦康凯琼脂平板上不表现生长。实验结果符合巴氏杆菌的培养特性。取分离菌进行生化试验，结果不液化明胶；能分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇，但产酸不产气；不发酵乳糖、山梨醇、鼠李糖和木糖；尿素、O-F试验为发酵型。符合多杀性巴氏杆菌的生化试验特征。同时，所分离的菌株在小白鼠致病试验中均能使实验动物致死，死亡动物体内所分离出的细菌与所接种的病原菌相同，可以说明在本试验病例体内分离出的菌株为致病性巴氏杆菌。

3.2生化试验表明，多数分离菌株完全符合猪巴氏杆菌生化特性，但也有部分菌株在个别项目上不符，因此，在做猪巴氏杆菌的生化试验时，应多设一些有针对性的项目，以便在个别项目不符时，不致误判。

3.3药敏试验结果显示，猪巴氏杆菌存在广泛的耐药性，猪场在治疗猪巴氏杆菌病时，不要盲目的用药，加大用药剂量，最好做药敏试验筛选出高敏药物，交替进行治疗。

3.4临床上本病的发生与饲料、饮水污染、气候变化、环境卫生等有密切的关系。因此，临床防治本病，除了注射疫苗、合理选择用药外，应从饲料、卫生、饲养管理等方面综合考虑，才能到达预期的效果。

3.5研究仔防治猪巴氏杆菌的意义：随着养猪业的发展，由猪巴氏杆菌引起猪巴氏杆菌病表现出很多种类型是目前养猪场影响仔猪存活率的重要制约因素，所以研究防治猪巴氏杆菌病在实际生产中具有重要的意义。