马小娟，韦小敏，来航线，房艳华，胡轶伦

(西北农林科技大学 a 资源环境学院，b 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)



斜卧青霉转录调控蛋白Hac1过表达菌株的构建

马小娟a，韦小敏a，来航线a，房艳华a，胡轶伦b

(西北农林科技大学 a 资源环境学院，b 生命科学学院，陕西 杨凌 712100)

【目的】 以增强型绿色荧光蛋白为报告基因，构建斜卧青霉转录调控蛋白Hac1激活形式基因(Hac1i)随机插入过表达菌株和非激活形式基因(Hac1u)原位插入过表达菌株，并初步观察Hac1基因的2种不同编码蛋白在菌丝内部的运动情况，为进一步研究转录调控蛋白Hac1的功能奠定基础。【方法】 分别克隆ptrA筛选标记、gpdA启动子、Hac1i编码区、eGFP编码区及终止子，利用融合PCR融合克隆片段，构建Hac1i随机插入表达盒；再分别克隆Hac1上游臂及编码区、eGFP编码区及终止子、ptrA筛选标记、Hac1下游臂序列，融合克隆片段，构建Hac1u原位插入表达盒。将2种表达盒分别转化斜卧青霉原生质体，通过吡啶硫胺素筛选标记、PCR扩增等检测获得阳性转化子，荧光显微镜观察融合蛋白的表达及运动情况。【结果】 成功构建了Hac1i基因随机插入表达盒和Hac1u基因原位插入表达盒，利用原生质体转化将2种表达盒转入宿主斜卧青霉菌株，经PCR初步验证，得到了阳性转化子。阳性转化子在麸皮培养基上培养2～4 d后，可在菌丝内部清晰观察到强烈的绿色荧光信号，表明融合蛋白在菌丝体内得到了正确表达。【结论】 成功构建了Hac1i基因随机插入和Hac1u基因原位插入菌株。

斜卧青霉；荧光蛋白；转录调控蛋白Hac1

丝状真菌由于具有卓越的蛋白分泌能力，已被广泛应用于多种工业用酶，如纤维素酶、半纤维素酶、淀粉酶、果胶酶等的生产中[1-2]。……