朱莉莉，周健，明红梅，陈晓旭，姚霞，李蓉，刘禹孟（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

浓香型大曲复合功能酵母菌的筛选及鉴定

朱莉莉，周健*，明红梅，陈晓旭，姚霞，李蓉，刘禹孟
（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

从浓香型大曲分离的酵母菌中，筛选出发酵力、酯化力和脂肪酶活力复合功能较高的菌株，为构建浓香型大曲复合功能菌群提供重要资源。以从浓香型大曲中筛选得到的10株酵母菌为研究对象，利用脂肪酶平板鉴定法初步确认10株酵母均具有脂肪酶功能，并对这10株酵母进行单菌小麦固体培养基发酵，测定发酵产物发酵力、酯化力和脂肪酶活力，复筛出一株复合功能性突出的菌株J17，该菌株的发酵力为2.02 g/（g·72 h），酯化力为114.13 U，脂肪酶活力为6.37 U/g。结果发现，J17发酵后能产生较为丰富的风味物质，经扫描电镜观察结合分子生物学鉴定，J17为酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）。

浓香型大曲；发酵力；酯化力；脂肪酶活力；分子生物学鉴定

大曲是以小麦、大麦、豌豆等为原料制成的形状较大且含有多菌酶类的曲块［1］。大曲素有“酒骨”之称，其含有的多种微生物及酶类在酒精发酵过程中起着重要的糖化、发酵等作用［2］。大曲微生物包括细菌、酵母、霉菌和放线菌［3］，酵母菌是产酒与生香的关键功能菌，影响白酒的出品率及其香味成分，是白酒酿造中的主要功能菌之一，对功能性酵母菌的研究势在必行［4］。大曲中的酵母菌主要有酿酒酵母属、假丝酵母属、毕赤酵母属、伊萨酵母属、汉逊酵母属、结合酵母属、德巴利氏酵母属和红酵母属［5］。目前，对大曲酵母菌的研究多集中在分离、筛选及鉴定方面［6-8］，对酵母复合功能研究较少。研究复合功能菌，有利于扩大菌种的应用范围，即可用于单一功能强化大曲，还可以应用于多功能性大曲。本研究中的复合功能包括发酵力、酯化力和脂肪酶活力3种功能，在酿酒发酵过程中，酵母菌能利用经淀粉转化的葡萄糖产生乙醇，同时酵母菌还可以产生多种醇、醛、酯等香味物质［9］。酯化酶可用于白酒增香和提高出酒率［10］；而脂肪酶可分解脂肪，有利于减少原料中脂肪带给酒体的强脂肪臭味和刺激感［11］。目前对于大曲中产脂肪酶酵母菌的研究开展较少。

本研究目的是找出发酵力、酯化力和脂肪酶活力复合功能酵母菌，能为构建浓香型大曲复合功能菌群以及提高大曲质量作出贡献。本研究先从大曲资源中筛选发酵力、脂肪酶和酯化酶活力复合功能菌株，丰富了菌种资源，为下一步大曲复合功能菌群的构建及优质曲异地化生产打下基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

1.1.1菌种来源

试验初期从浓香型大曲中筛选获得的10株酵母菌。

1.1.2培养基

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20 g，琼脂20 g，pH自然。马铃薯去皮，切成块煮沸30 min，然后用纱布过滤，再加入葡萄糖及琼脂，溶化后补充蒸馏水至1 000 mL。

YPD培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母膏10g，溶于1000 mL蒸馏水中，调节pH至5.0～5.5。

脂肪酶筛选培养基：橄榄油乳化液120 mL，琼脂粉20 g，加入自来水补足至1 000 mL，调节pH为7.0，加入适量1.6%溴甲酚紫溶液［12］，制备橄榄油乳化液时乳化剂为2%的聚乙烯醇溶液。以橄榄油乳化剂为唯一碳源，调节培养基的pH，利用溴甲酚紫的变色范围5.2（黄色）～6.8（紫色），酵母在生长代谢过程中利用橄榄油产生脂肪酸类物质，使培养基中的pH发生变化，使培养基颜色发生变化，根据是否产生变色圈及变色圈的大小来判断酵母产脂肪酶能力的大小［13］。

小麦固体培养基：取80 g小麦固体培养基，于250 mL锥形瓶中，调节小麦原料含水量38%。

1.1.3试剂

葡萄糖、氢氧化钠、硫酸、正己酸、无水乙醇、碘、碘化钾、邻苯二甲酸氢钾、聚乙烯醇（以上试剂均为AR）：购自成都科龙化工试剂厂；溴甲酚紫（指示剂）：购自成都科龙化工试剂厂；橄榄油（化学纯）：购自成都科龙化工试剂厂；酵母膏、蛋白胨、糖化酶（以上试剂均为BR）：购自成都科龙化工试剂厂；琼脂糖和蜗牛酶（生物技术级）：购自北京索莱宝科技有限公司；DNAMaker DL1500、Taq酶：购自Takara大连宝生物工程有限公司；蛋白酶K：购自Biosharp公司；真菌26SrDNA通用引物ITS1：TCCGTAGGAACCTGCGG和ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC：由上海英潍捷基生物技术公司合成。

1.1.4主要仪器设备

SKY-2102C恒温培养振荡器：上海苏坤实业有限公司；GZ-250-HSⅡ恒温恒湿箱：韶关市广智科技设备有限公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS固相微萃取头、手动SPME进样器、15 mL带硅橡胶垫的样品瓶：美国Supelco公司；My Cycler型PCR仪：美国BIARAD公司；SC-805凝胶成像仪：上海山富科学仪器有限公司；气相色谱-质谱联用仪：美国Agilent Technologies；扫描电子显微镜：捷克TESCAN。

1.2方法

1.2.1平板透明圈法筛选高产脂肪酶活酵母

配制活化培养基，即PDA培养基，121℃灭菌30min，在无菌条件下倒入平板中，将实验室保藏的酵母菌，划线接种到平板培养基上，放置30℃恒温培养箱中倒置培养至长出明显的单菌落，备用。

配制脂肪酶筛选培养基，121℃灭菌30 min，在活化培养基上挑选单菌落，用灭菌的牙签点接到筛选培养基上，放置30℃恒温培养箱培养3 d，观察试验现象，挑选菌落边缘培养基颜色变化明显的平板进行拍照，并用尺子测定菌落直径和变色圈直径。

1.2.2固态发酵

配制YPD培养基，量取100 mL于250 mL锥形瓶中，8层纱布盖住瓶口，再用牛皮纸包扎好后于115℃下灭菌30 min，备用。从冰箱中取出斜面菌种，无菌操作台上，在酒精灯旁，用接种环挑选适量菌落于锥形瓶中，整个过程注意无菌操作。接种好后，将锥形瓶置于恒温摇床中，30℃，150 r/min，振荡培养48 h。

分装好小麦固体培养基后，121℃灭菌30 min，放置1 d，无菌操作条件下，用移液枪将培养好的酵母种子液按10%的接种量接种到装有80 g小麦固体培养基的锥形瓶中，混合均匀，将接种好的培养基于30℃恒温培养箱中，静置培养72 h，中间间歇手工振荡。

1.2.3固态发酵产物主要功能特性分析

固态发酵产物主要功能特性：脂肪酶活力、发酵力和酯化力的测定参照文献［14-15］进行。

1.2.4固态发酵产物的挥发性成分分析

固态发酵产物的挥发性成分的测定参照文献［16］进行。

1.2.5功能酵母菌株鉴定

对筛选出的功能性突出的酵母菌株采用扫描电子显微镜进行形态观察并进行分子生物学鉴定。

菌种培养：将筛选出的功能性菌株接种PDA液体培养基中，30℃，200 r/m，培养48 h。

DNA提取与序列测定：将上述培养好的种子液离心取沉淀，采用酶解法、CTAB法和反复冻融法相结合的方法提取单菌DNA，DNA溶解液进行电泳观察，并采用真菌26SrDNA通用引物ITS1：TCCGTAGGAACCTGCGG和 ITS4：TCCTCCGCTTATTGATATGC进行PCR扩增，电泳后条带亮而清晰的样品，送上海杰李生物技术有限公司测序。

序列分析：采用序列图谱软件Chromas，参照正、反向序列图谱，对序列人工校对。采用NCBI的BLAST功能将校对后的序列与GeneBank中的序列进行比对。利用MEGA5.0软件进行多重序列同源性比对分析，并采用邻接法（Neighbor-Joiningmethod）构建系统发育树。

2　结果与分析

2.1产脂肪酶酵母菌平板初筛

将实验室初期筛选自浓香型大曲的10株酵母菌，无菌条件下，点接到脂肪酶筛选培养基培养，观察试验现象，培养3 d后将菌落周围有颜色变化的平板进行拍照，变色明显的图片如图1所示。并测定了菌落直径和变色圈直径大小（分别用C和B表示），其结果如图2。

图1　部分产脂肪酶酵母菌初筛结果Fig.1　Part screening results of lipase-producing yeast

从图1可以看出，J17、J19、J15菌落周围的黄色较为明显，说明产脂肪酶能力较强，另外，J1、J3、J4、J5、J6、FJ1、J10菌落周围的黄色不明显，说明产脂肪酶能力一般。

由图2可以得到，J17的脂肪酶活力显著高于其余6株菌株（P＜0.05）；另外，点接酵母J1、J6、FJ1的脂肪酶鉴定平板上菌落周围变色圈不明显，常规直尺不易测量。酵母点接到脂肪酶筛选培养基中，平行的3个培养基中酵母的生长情况基本相同。

2.2固态发酵产物复合功能特性检测

图2　变色圈直径和菌落直径比值测定结果Fig.2　The result of the measurement of diameter ratio ofcolor-change ring and colonies

通过上述平板鉴定试验，得到这10株酵母均具有产脂肪酶的能力，对这10株酵母菌进行单菌固态发酵，30℃培养72 h之后，测定各菌株的发酵力、酯化力和脂肪酶活力，结果见表1，发现只有J10、J17和J19的脂肪酶活能检测出，这3株菌同时还具有较高的发酵力和酯化力。另外，J10、J17和J19在发酵基质上生长旺盛，呈现均匀白色点状菌体，发酵基质具有浓郁的酒香味和令人愉悦的香味，其它酵母发酵后均未产生令人愉悦的香味，或者无味。

表1　各菌株发酵产物的脂肪酶活力、发酵力和酯化力结果Table 1　The result of fermentation acitivity and esterase activity ofstrains fermentation products

由表1可知，10株酵母固态发酵产物的发酵力均大于2 g/（g·72 h），与张春林研究的中温优级大曲发酵力最高0.69 g/（g·72 h）［3］以及一级大曲发酵力大于1.2 g/ （g·72 h）［14］相比，本研究中的酵母菌发酵力水平较高。说明这些酵母菌产乙醇能力很强；与张春林研究的中温优级大曲酯化力221.8 mg/（g·100 h）以及大曲传统标准中优质曲的酯化力相比，10株酵母固态发酵产物的酯化力水平一般［17］。J17固态发酵产物的脂肪酶活力最高，具有较高的转化脂肪类物质的能力。

综合来看，酵母J17的复合功能较为突出，进一步研究其挥发性发酵产物。

2.3固态发酵产物挥发性风味物质测定结果

对J17菌株发酵3d的固态产物采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术测定其中的挥发性物质，其萃取的挥发性成分的总离子流色谱图如图3所示，分析鉴定出的挥发性风味物质如表2所示。小麦固体培养基中挥发性成分的总离子流色谱图如图4所示，分析鉴定出的挥发性风味物质如表3所示。

由表2和表3对比可以看出，添加了酵母菌的小麦固态发酵产物的挥发性成分与不添加菌株的小麦培养基挥发性成分相比发生了较大的变化，说明酵母菌及其产生的酶类，在一定温度和时间的条件下，催化了小麦原料中的成分转化形成具有浓香型大曲特征的香味物质。酵母菌株J17发酵小麦固体培养基后共获得香味物质10种。这些香味物质中乙酸乙酯的相对含量最高，达到57.94%，乙酸乙酯是白酒香味的重要物质［6］，是四大酯类之一。酯类物质相对含量最高，达到73.45%，其次是醇类，达到10.29%，其中，苯乙醇是浓香型大曲中重要的风味成分。其他酚类物质，例如愈创木酚，也是浓香型大曲中重要的香味成分的组成部分［18］。发酵物中的醇类物质可以为酯化酶提供醇类前体物，同时，脂肪酶活力可以提供脂肪酸类前体物［19-20］。可见，酵母菌的发酵力、脂肪酶活力和酯化力的作用，产生了大曲中众多的风味成分。

图3　J17发酵产物挥发性成分总离子流色谱图Fig.3　The GC-MS total ion current chromatogram of volatile substance fermented by J17

图4　小麦固体培养基中挥发性成分总离子流色谱图Fig.4　The GC-MS total ion current chromatogram of volatile substance in wheat solid medium

2.4功能菌株鉴定结果

将斜面保藏菌种转接到PDA固体平板培养基上，30℃恒温培养24 h后，结果如图5所示。图5表明，该菌的形态特征为：菌落为乳白色，质地均匀，菌体较湿润、不透明，表面较光滑，中央有明显凸起，易挑起，酒香气味浓郁。

表2　J17发酵产物挥发性风味物质测定Table 2　Determination of volatile fragrance substances of J17 fermentation products

表3　小麦固体培养基挥发性香味物质测定Table 3　Determination of volatile fragrance substances in wheat solid medium

图5J17的平板菌落图Fig.5　Colony picture of J17

进一步以锡箔为载体，自然干燥后，喷金，用电子扫描显微镜进行观察拍照，结果如图6所示。经过对J17菌体进行DNA提取、目的片段PCR扩增，PCR扩增后的电泳图，如图7所示。将PCR产物送上海杰李公司测序，测序结果在GeneBank数据库中进行比对，结果表示，菌株 J17与 Saccharomyces cerevisiae KC544486.1相似性为99%。利用Mega5.0软件通过N-J法对菌株J17分别构建系统发育树，结果如图8所示。根据菌株形态和菌株rDNA的相似性，初步鉴定J17为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。

图6　扫描电镜下J17的形貌图Fig.6　Scanning electron microscape individual form diagram of J17

图7目的片段PCR扩增后电泳图Fig.7　Electrophoresis after PCR amplification of purpose fragment

图8　基于26SrDNA序列同源性构建的菌株J17系统发育树Fig.8　Unrooted phylogenetic trees based on the 26S rDNA sequence of strain J17

3　结论

我国浓香型白酒是白酒香型中重要香型之一，浓香型大曲作为白酒酿造的重要微生物菌系、酶系和物系的载体，富含大量有用的微生物群落资源。本研究以从浓香型大曲中筛选得到的10株酵母菌为研究对象，利用脂肪酶平板鉴定法初步确认这10株酵母均具有产脂肪酶功能，并对这10株酵母进行单菌小麦固体培养基发酵，对发酵产物测定发酵力、酯化力和脂肪酶活力，复筛出一株复合功能性突出的菌株J17。进一步对J17采用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术测定其中的挥发性物质，结果发现，这株菌发酵后能产生较为丰富的风味物质，比如乙酸乙酯、苯乙醇和愈创木酚等，这些物质在浓香型白酒香味成分中占有重要位置。经扫描电镜观察结合分子生物学鉴定，J17为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）。可见，本次研究的结果获得了一株具有较高发酵力、酯化力和脂肪酶活力的复合功能菌株，且发酵产物中含有乙酸乙酯等香味成分，乙酸乙酯的形成和发酵力、酯化力之间有一定的内在联系。本研究中，酯化力以己酸乙酯为检测指标，酵母J17的酯化力一般，而其发酵产物中乙酸乙酯含量较高，说明该菌株产乙酸乙酯能力较强。今后以其它酯类物质为检测指标研究酵母的酯化力，以充分认知酯化酶与香味成分之间的相互关系，指导酿酒工艺生产。

研究大曲功能性菌株，充分挖掘它们的各种功能，还需要筛选多种类型的功能性细菌、酵母、霉菌，研究它们的糖化、液化、产酒、产香功能性，利用它们之间的协调性，对多种功能微生物进行组合优化，对提高大曲质量具有重要的研究价值和应用前景。

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Selection and Identification of Composite Functional Yeasts from Luzhou-flavor Daqu

ZHU Li-li，ZHOU Jian*，MING Hong-mei，CHEN Xiao-xu，YAO Xia，LI Rong，LIU Yu-meng
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Functional strains with lipase activity，high fermentation activity and esterification force were selected from the yeasts that were isolated from Luzhou-flavor Daqu，which provided significant resources for constructing Luzhou-flavor Daqu functional microorganisms group.10 yeasts from Luzhou-flavor Daqu were researched as the objects.10 Lipase functional strains were preliminarily determine by lipase flat evaluating method，and this 10 strains were separately cultured in solid medium with wheat and fermentation activity，esterification force and lipase activity of the fermentation products were measured.The results showed that，there was a complex functional outstanding strain，number J17，with fermentation activity 2.02 g/（g·72 h），esterification force 114.13 U and lipase 6.37 U/g.The results showed that，comparatively abundant flavor components were producted after fermentation of J17.J17 belonged to Saccharomyces cerevisiae by morphological observation and identification of molecular biology.

Luzhou-flavor Daqu；fermentation activity；esterification force；lipase activity；identification of molecular biology

2015-09-11

泸州老窖科研奖学金项目（13ljzk04；15ljzk06）；四川省教育厅重点科研项目（15ZA0219）；四川省大学生创新训练计划项目（201410622004）；研究生创新基金（y2014021）；酿酒及生物技术四川省重点实验室项目（NJ2014-05）

朱莉莉（1990—），女（汉），在读研究生，研究方向：发酵工程。

周健（1963—），男，教授，硕士生导师，研究方向：环境生物技术。