杨文斌，罗惠波，叶光斌，边名鸿，万世旅，钟姝霞（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

溪黄草中黄酮类物质的提取工艺优化

杨文斌，罗惠波，叶光斌，边名鸿*，万世旅，钟姝霞
（四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000）

研究利用超声波辅助提取溪黄草中黄酮类化合物的工艺条件。以黄酮类物质提取率为指标，通过单因素试验、正交试验确定了溪黄草中黄酮类物质的最佳提取工艺条件。结果表明：溪黄草黄酮类物质的最佳提取工艺条件为：超声功率为225 W，乙醇浓度为65%，提取温度为50℃，料液比为1∶46（g/mL），超声提取时间25 min。在最优条件下，黄酮类化合物的提取得率可达6.84%，提取的效果最佳，且资源消耗低。

溪黄草；黄酮类物质；提取工艺；超声提取

溪黄草为唇形科植物线纹香茶菜的干燥全草，又名山熊胆、风血草、黄汁草和手擦黄等，具有清热利湿、退黄、凉血散瘀之功，用于湿热黄疸、湿热泻痢、跌打瘀肿。然而，目前对于溪黄草的开发利用不足，仅限于溪黄草袋泡茶、溪黄草冲剂及用于加工成复方中成药等。而黄酮类化合物被认为是溪黄草中主要有效成分之一，具有清除自由基、抗氧化、抗突变、抗炎、抗菌、舒张血管等功能［1-5］，因此对于溪黄草中黄酮类物质的提取、开发、利用具有较大的实际意义和经济价值［6］。

黄酮类物质常用的提取方法有微波辅助提取法、有机溶剂提取法、水浸法、酶辅助提取法等。其中超声波辅助提取法相对其他方法而言具有许多优点：操作较为简单；成本低；提取效率较高；适用于提取热敏性物质；萃取快速且比较完全；适用范围很广等［7］。本文主要采用单因素试验和正交试验对溪黄草中黄酮类化合物的提取工艺进行优化，旨在为溪黄草中药材的开发与利用提供一定的理论参考和技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

溪黄草：市售，将溪黄草置于60℃烘箱内干燥至恒重后粉碎，粒度在50目～300目，置于封口袋中备用。

芦丁标准品：中国食品药品检定研究所；乙醇、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丙酮、丙三醇、乳酸、NaNO2、Al（NO3）3、NaOH：均为分析纯，成都科龙化工试剂厂。

1.2仪器与设备

T6新世纪紫外/可见分光光度：北京普析通用仪器有限公司；AR2140电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；KQ5200DB数控超声清洗器：昆山市超声仪器有限公司；DHG-9245A电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；TDL-50大容量平衡离心机：金坛市旺实验仪器厂。

1.3方法

1.3.1总黄酮标准曲线的绘制

准确称取干燥至恒重的芦丁10 mg，用60%微热乙醇于烧杯中溶解，后移至100 mL容量瓶定容，得浓度为0.1 mg/mL的标准液。准确吸取标准液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL于6只具塞试管中，加30%乙醇至6 mL，加5%NaNO2溶液0.3 mL，摇匀，放置6 min。加10%Al（NO3）3溶液0.3mL，摇匀，放置6 min。加1mol/L NaOH溶液4 mL，摇匀，放置10 min～15 min，于510 nm波长处测定吸光度，并绘制出标准曲线［8］。

1.3.2总黄酮提取工艺优化试验

1.3.2.1提取方法的确定

索式提取法：准确称取2.00g溪黄草粉末于索氏提取器中，加入200mL的70%乙醇溶液，95℃水浴约12 h，至提取器中液体为无色，取出提取液定容至200 mL，测其吸光度，求得提取得率［9］。

水浸提取方法：准确取1.50 g溪黄草粉末，加入150 mL水，60℃水浴，离心，过滤至无明显悬浮颗粒为止，定容并测其吸光度。

超声波辅助提取方法：准确取1.50 g溪黄草粉末，加入150 mL 70%的乙醇，60℃超声波处理30 min，离心，定容并测其吸光度。

乙醇浸泡提取方法：准确取1.50 g溪黄草粉末，加入150 mL 70%的乙醇，于60℃水浴2 h，离心，定容并测其吸光度。

1.3.2.2单因素试验

以1.00 g溪黄草粉末为提取对象，固定乙醇浓度70%，料液比1∶30（g/mL），提取温度50℃，超声功率225 W，超声处理25 min，离心，测其吸光度。在此工艺条件基础上，变动其中1个因素，分别探讨其对黄酮得率的影响。

1）超声波功率设计：150、175、200、225、250 W 5个水平；

2）溶剂类型设计：乙醇、乙酸、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丙酮、丙三醇和乳酸7个因素；

3）超声时间设计：15、20、25、30、35 min 5个水平；

4）乙醇浓度设计：40%、50%、60%、70%、80%、90%（体积比）6个水平；

5）料液比设计：1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70（g/mL）7个水平；

6）提取温度设计：40、50、60、70℃4个水平。

1.3.3总黄酮提取的正交试验

根据上述单因素试验确定的范围，对乙醇浓度、料液比、水浴温度和超声波处理时间度为考察的因素，其中单因素选取范围见表1。以得率为指标，采用标准正交表L16（44）设计正交试验，其中设置1组空白，分析结果得出溪黄草中黄酮类物质的最佳提取工艺条件。

表1 试验因素水平设计表Table 1　The level of experimental factors design

1.3.4得率的计算

得率/%=总黄酮的质量/原料的质量×100

2　结果分析

2.1总黄酮标准曲线

芦丁标准曲线如图1所示。

图1芦丁标准曲线Fig.1　Standard curve of rutin

试验结果如图1所示，以芦丁浓度x对吸光度y进行线性回归，回归方程为y=1.296 4x-0.006 4，R2= 0.998 8，芦丁浓度在0～0.5 mg/mL的范围内呈良好线性关系。

2.2影响总黄酮提取率的单因素试验

2.2.1提取方法的确定

不同方法对提取得率的影响如图2所示。

图2　不同方法对提取得率的影响Fig.2　The effect of different methods on extraction rate

由图2可知，在料液比、溶剂浓度等试验条件相同的情况下，超声波辅助提取法的得率为6.07%，明显优于索氏提取法（5.17%）、乙醇浸泡提取法（4.85%）和水浴浸泡提取法（2.93%）。因此后续试验选择超声波辅助提取法。

2.2.2不同超声功率对黄酮类物质提取得率的影响不同超声功率对提取得率的影响如图3所示。

图3　不同超声功率对提取得率的影响Fig.3　Effects of different ultrasonic power on extraction rate

由图3可知，随着功率的增大，超声波对细胞壁的破碎作用增强，胞内黄酮类物质溶出速率增加，故其提取率逐渐增大［10］，当超声功率为225 W时，黄酮类物质提取率达最大值；当功率继续增大到一定程度时，会造成局部温度过高，黄酮类物质易在高温条件下发生降解和氧化［11］，使提取率降低。故225 W为最适超声功率。

2.2.3不同溶剂对黄酮类物质提取得率的影响

图4 不同溶剂对提取得率的影响Fig.4　The effect of different solvent on extraction rate

不同溶剂对提取得率的影响如图4所示。由图4可知，以乙醇作为溶剂的得率均优于其他溶剂，其得率为5.04%明显高于水作为溶剂的提取得率（2.53%），其后则是乙酸（4.09%）、乙酸乙酯（4.15%）和丙酮（4.17%）等提取得率较高。综合考虑溶剂成本，选择乙醇作为提取溶剂。

2.2.4不同提取时间对黄酮类物质提取得率的影响不同提取时间对提取得率的影响如图5所示。

图5　不同提取时间对提取得率得影响Fig.5　The effect of different time on extraction rate

由图5可知，在超声波处理15 min后到25 min之间提取得率不断增加，在超声波处理时间为25 min时，达到最高的提取得率6.47%，而在超声波处理25 min后，得率开始不断减少。其原因可能是因为时间的增加可以增加浸提的效果，但同时也会加大黄酮类化合物的破坏。因此，最佳的提取时间为25 min。

2.2.5不同乙醇浓度对黄酮类物质提取得率的影响

乙醇浓度对提取得率的影响如图6所示。

图6 乙醇浓度对提取得率的影响Fig.6　The effect of different Ethanol concentration on extraction g rate

由图6可知，在乙醇浓度为40%到70%范围内，黄酮类化合物的提取得率会随着乙醇浓度的升高而增加，在70%处达到最大值。乙醇浓度大于70%，黄酮类化合物的提取得率随着乙醇浓度的增加而降低。其原因可能是乙醇浓度过大，浸提体系中溶出较多醇溶性杂质、色素、亲脂性强的物质与黄酮类化合物竞争同乙醇-水分子复合体系结合，导致体系的通透性下降，使黄酮类化合物提取率下降。因此选择70%乙醇浓度为最佳乙醇浓度。

2.2.6不同料液比对黄酮类物质提取得率的影响

料液比对提取得率的影响如图7所示。

图7　料液比对提取得率的影响Fig.7　The effect of different ratio of liquid on material to extraction rate

由图7可知，料液比为1∶10（g/mL）和1∶20（g/mL）时，提取得率基本不变，约4.4%，而后在逐步提高料液比时提取得率也会增加，直到当料液比为1∶50（g/ mL）时，其得率达到为6.81%；随后即使增大料液比，提取得率变化不大，且用量过大会增加后续工艺的难度，能耗较高，也会加大黄酮类物质的损失［12］，所以最适料液比为1∶50（g/mL）。

2.2.7不同提取温度对黄酮类物质提取得率的影响

温度对提取得率的影响如图8所示。

图8 温度对提取得率的影响Fig.8　The effect of different temperature on extraction rate

由图8可知，随着温度升高，黄酮类物质提取得率在50℃时达到了最大值6.48%，温度继续升高，得率下降。其原因是由于升高温度有利于提取液中粘度的降低，从而可以提高黄酮类物质的提取率，但是当温度升高到一定程度，黄酮类物质的结构发生变化，导致提取率有所降低，综合考虑，最佳提取温度为50℃。

2.3正交试验结果分析

正交试验结果如表2所示，方差分析如表3所示。

表2 正交试验结果表Table 2　The orthogonal experiment results table

表3 方差分析表Table 3 The variance analysis table

由方差分析可知，C因素F值FC＞F0.05为显著影响的因素，显著性水平取0.05；F0.05＞FA＞FD＞FB，故A、D和B 3个因素均达不到显著水平，即，乙醇浓度、提取时间和料液比均为不显著因素。A、B、C和D 4个因素的极差大小排序为C＞A＞B＞D，4个因素影响次序为：浸提温度＞乙醇浓度＞料液比＞浸提时间。再各个因素均值大小，可得到每个因素的最佳水平。因此，该试验的最佳提取工艺为C2A1B4D2，即水浴温度为50℃，溶剂为65%乙醇，料液比1∶46（g/mL），超声波处理时间为25 min。

最优提取工艺条件的验证性试验结果见表4。

表4　验证试验结果Table 4　The results of verification tests

3　结论

由表4可知，正交优化试验后最佳提取工艺下的试验结果优于各单因素试验结果，所以试验的结果能够显示出正交优化试验具有良好的试验结果，具有可操作性，而且试验结果的相对标准差为0.369，可见试验结果的稳定性很好，因此，该试验的最佳提取工艺为C2A1B4D2，即水浴温度为50℃，溶剂为65%乙醇，料液比1∶46（g/mL），超声波处理时间为25 min。

本文通过单因素试验、正交试验得出溪黄草黄酮类物质的最佳提取工艺条件为：超声功率225 W，提取温度50℃，溶剂为65%乙醇，料液比1∶46（g/mL），超声波处理25 min，在此条件下黄酮类物质的提取率可达6.84%，黄酮类物质的提取率高，资源消耗低，且通过验证试验分析可知，该提取工艺条件的可操作性强，稳定性好，为溪黄草黄酮类物质的提取提供了理论和技术参考。

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Optimization of the Extraction Process of Flavonoids from the Linearstripe Rabdosia Herb

YANG Wen-bin，LUO Hui-bo，YE Guang-bin，BIAN Ming-hong*，WAN Shi-lü，ZHONG Shu-xia
（College of Bioengineering，Sichuan University of Science&Engineering，Zigong 643000，Sichuan，China）

Process conditions of flavonoids extracting from Linearstripe Rabdosia Herb by ultrasonic wave were studied.The yield of flavonoids was considered as the indicator to optimize the main influencing factors of extraction of Linearstripe Rabdosia Herb by single factor test and orthogonal experiment design.The results suggested that the extraction yield of flavonoids was 6.84%under the condition of 225 W，50℃，25 min，the alcohol concentration and the ratio of the Linearstripe Rabdosia Herb to extraction solvent were respectively 65% and 1∶46（g/mL）.

Linearstripe Rabdosia Herb；flavonoids；extraction process；ultrasonic extraction

2015-09-12

杨文斌（1989—），男（汉），硕士研究生，主要从事发酵工程方向的研究。

边名鸿（1979—），女，副教授，主要从事发酵工程相关的教学与科研工作。