赵玉红，林洋，张智，王振宇（.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨50040；2.哈尔滨工业大学化工学院，黑龙江哈尔滨50090）

碱溶酸沉法提取黑木耳蛋白质研究

赵玉红1，林洋1，张智1，王振宇2,*
（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040；2.哈尔滨工业大学化工学院，黑龙江哈尔滨150090）

为优化黑木耳蛋白质的碱溶酸沉法提取工艺，考察料液比、提取时间、提取温度、碱液浓度对黑木耳蛋白质得率的影响。采用响应面法优化黑木耳蛋白质提取的工艺条件。结果表明：黑木耳蛋白质的最佳提取工艺参数为：提取温度50℃、料液比1∶90（g/mL）、提取时间2.5 h、碱液浓度0.07 mol/L。在此最佳条件下，黑木耳蛋白质的得率为4.52%。由此可知，碱溶酸沉法可以较好地提取黑木耳蛋白质。

黑木耳；提取；蛋白质；响应面优化

黑木耳（Auricularia auricula），又名云耳、光木耳、木菌、树鸡，木耳科木耳属。性平味甘，具有滋补、润燥、养血益胃、润肺的作用［1］。常食用可益气养神、滋阴润燥，增强抵抗力，延年益寿。黑木耳富含蛋白质、氨基酸、多糖、及钙、铁、磷等人体所需的矿物质元素［2-5］。黑木耳作为一种营养丰富的食用菌，具有很高的研究和利用价值。

国内外对黑木耳的研究主要集中在黑木耳多糖的提取和功能性质研究［6-10］，对其含有的蛋白质研究较少，文献报道的有刘静波等人［11］采用酶法提取黑木耳胶原蛋白，产品得率为1.07%；王振宇等［12］采用传统水提法提取黑木耳蛋白质，产品得率为2.6%。黑木耳以蛋白质含量高、脂肪热量低等优势，已成为获取植物蛋白的新兴资源，而传统水提法和酶法提取的黑木耳蛋白质的得率都较低，不利于后续应用，因此提取方法有待进一步改进。常规的植物蛋白提取方法有碱溶酸沉法、酶法、非蛋白质法、复合法等［13-15］，其中碱溶酸沉法具有简单易行、成本低、提取得率及纯度较高等特点，目前国内外对采用碱溶酸沉法提取黑木耳蛋白质的研究尚鲜见报道。本文采用碱溶酸沉法提取黑木耳中蛋白质，在单因素试验的基础上，采用响应面法优化黑木耳蛋白质的提取工艺，为黑木耳蛋白质提取效率的提高和进一步利用提供参考。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

黑木耳：采摘自黑龙江省大兴安岭，自然风干后粉碎过100目筛，石油醚脱脂24 h。

试剂：氢氧化钠、石油醚、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、无水乙醇、浓磷酸，均为分析纯，购于哈尔滨市盛达试剂化学有限公司。

1.2仪器与设备

DK-S12型电热恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；TDL-5W型台式低速离心机：湖南星科科学仪器有限公司；722型可见光分光光度计、YP2001N型台秤：上海精密科学仪器有限公司；JA-2003型分析天平：上海良品仪器仪表有限公司；FW100型高速万能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司等。

1.3方法

1.3.1标准曲线的制备

取0.1 mg/mL牛血清蛋白标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL分别置于6只试管中，加水至1.0 mL，之后各加入5.0 mL考马斯亮蓝G-250，振荡，充分混合，5 min后在595 nm波长下测定吸光度［16］。以蛋白质含量为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得线性回归方程为y=0.007 2x+0.020 9（R2=0.997）。

1.3.2黑木耳蛋白质得率的计算

取黑木耳粉进行碱法提取，离心，得上清液。考马斯亮蓝法测定上清液中蛋白质含量，蛋白质得率公式如下：

式中：M1：上清液中蛋白质含量，mg/g；M2：原料质量，mg/g。

蛋白质沉淀率公式如下：

式中：M1：提取液中蛋白质含量，mg/g；M2：沉淀后上清液中蛋白质含量，mg/g。

1.3.3黑木耳蛋白质等电点的确定

在最佳提取条件提取黑木耳蛋白质，将提取液分装于50mL烧杯中，每个30mL，用1mol/LHCl调提取液pH分别为2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5。8 000 r/min离心20 min，取上清液采用考马斯亮蓝法测定蛋白质含量，计算蛋白质沉淀率。

1.3.4黑木耳蛋白质提取单因素试验

1）提取时间对蛋白质得率的影响取黑木耳粉1 g，按料液比1∶50（g/mL）加入0.06 mol/L NaOH溶液，搅拌均匀，40℃水浴，分别提取1、1.5、2、2.5、3、3.5 h。4000 r/min离心10 min，取上清液，采用考马斯亮蓝法测定黑木耳中蛋白质含量。

2）料液比对蛋白质得率的影响 取黑木耳粉1 g，按不同料液比（1∶30、1∶50、1∶70、1∶90、1∶110、1∶130，g/mL）加入0.06 mol/L NaOH溶液，搅拌均匀，40℃水浴2.5 h。4000 r/min离心10 min，取上清液，采用考马斯亮蓝法测定黑木耳中蛋白质含量。

3）碱液浓度对蛋白质得率的影响 取黑木耳粉1g，按料液比1∶50（g/mL）加入不同浓度（0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09 mol/L）NaOH溶液，搅拌均匀，40℃水浴2.5 h，4000 r/min离心10 min，取上清液，采用考马斯亮蓝法测定黑木耳中蛋白质含量。

4）提取温度对蛋白质得率的影响 称取黑木耳粉1 g，按料液比1∶50（g/mL）加入0.06 mol/L NaOH溶液，搅拌均匀，不同温度下（35、40、45、50、55、60℃）水浴提取2.5 h。4 000 r/min离心10 min，取上清液，采用考马斯亮蓝法测定黑木耳中蛋白质含量。

1.3.5响应面试验

在单因素试验基础上，以提取时间、料液比、碱液浓度为自变量，蛋白质得率为响应值，建立回归方程模型。根据Design-Expert 8.0.5软件Box-Benhnken原理采用响应面法在三因素三水平对黑木耳蛋白质的提取条件进行优化，试验设计方案见表1。

表1 试验因素水平及编码表Table 1　Vairables and levels in Box-Benhnken experimental design

2　结果与讨论

2.1碱法提取黑木耳蛋白质的单因素试验

2.1.1提取时间对蛋白质得率的影响

提取时间对蛋白质得率的影响见图1。

图1　提取时间对蛋白质得率的影响Fig.1　The effect of extraction time on protein yield

由图1可知，蛋白质得率随时间的增加增幅明显，黑木耳蛋白质不断被浸提出来。当提取时间为2.5 h时达到提取平衡，提取曲线呈现平缓趋势。这与谢昊宇等应用碱法提取青稞蛋白质［17］结果一致。这是由于在提取初期提取时间过短，原料尚未完全与溶液接触，此外，黑木耳粉末中的胶质和蛋白质结合的网状结构不易被破坏，蛋白质被包容在结构网内难以分离；而提取时间过长，多糖从胶质中分离出来，增加了体系的黏度，使多糖和蛋白质不易分离，离心效果受到影响。综合考虑，确定黑木耳蛋白质最佳提取时间为2.5h。

2.1.2料液比对蛋白质得率的影响

料液比对蛋白质得率的影响见图2。

图2 料液比对蛋白质得率的影响Fig.2　The effect of in solid-liquid ratio on protein yield

由图2可知，随料液比的逐渐增大，蛋白质得率增加，当料液比达到1∶90（g/mL）时，蛋白质得率达到最大值。原因可能是随着溶剂体积的增加，原料在溶剂中的分散度和接触面积增大，加速了黑木耳蛋白质的溶出，当继续增大溶剂体积到一定量时，原料的接触面积没有很大变化，蛋白质得率变化缓慢。与Jianmei等提取花生蛋白的结果一致［18］。由于黑木耳中富含粘性多糖，其在水溶液中能产生很高的粘度，阻碍蛋白质提取中的传质过程，因此只有当碱液提取的溶出效应与粘性多糖的阻遏效应达到平衡时，才能使蛋白质的得率达到峰值。此外，过大的料液比会造成提取液中蛋白质浓度偏低，不利于后续的蛋白质絮凝沉淀，同时还会增加废水产生量和处理成本。综合考虑，确定黑木耳蛋白质提取最佳料液比为1∶90（g/mL）。

2.1.3碱液浓度对蛋白质得率的影响

碱液浓度对蛋白质得率的影响见图3。

图3　碱液浓度对蛋白质得率的影响Fig.3　The effect of alkali concentration on protein yield

由图3可知，随NaOH浓度的增加，蛋白质得率逐渐变大，当NaOH浓度达到0.07 mol/L时，蛋白质得率达到最大值。这与王振斌等采用响应面优化芝麻饼粕蛋白的制备［19］结果一致。原因可能为黑木耳蛋白质的溶解性随NaOH浓度的增加而增大，但过高的NaOH浓度会使蛋白质变性，促使美拉德反应的发生，导致必须氨基酸的损失。同时降低蛋白质的营养价值和得率，而且会显著增加提取液的粘度，不利于后续的离心分离，造成蛋白质的损失较多。综合考虑，确定黑木耳蛋白质提取最佳NaOH浓度为0.07 mol/L。

2.1.4提取温度对蛋白质得率的影响

提取温度对蛋白质得率的影响见图4。

图4　提取温度对蛋白质得率的影响Fig.4　The effect of temperature on protein yield

由图4可知，随着提取温度的增加，蛋白质得率逐渐增大，当温度达50℃时，蛋白质得率达到最大值。当温度高于50℃时，随着温度的升高，蛋白质得率逐渐下降。这与李加兴等采用碱提酸沉法提取黄秋葵蛋白质［20］结果一致。这是由于温度的上升使蛋白质的构象发生改变，分子的立体结构变得伸展，有利于蛋白质分子和水分子的相互作用，使蛋白质的溶解性增大，促进了蛋白质的溶出。而过高的提取温度维持蛋白质空间构象的次级键被破坏，促进了蛋白质分子间相互结合而形成沉淀，使得蛋白质变性，增加了提取液的粘度，不利于蛋白质的溶出，其得率也随之下降。综合考虑，确定黑木耳蛋白质提取的最佳温度为50℃。

2.2响应面优化试验

2.2.1响应面试验结果

以料液比、提取时间、碱液浓度3个因素为响应变量，黑木耳蛋白质得率为响应值，采用响应面分析法进行三因素三水平试验设计。响应面试验设计及分析见表2。

回归方程为：

得率 =4.516+0.1A+0.08B+0.17C+0.02AB-0.065AC-0.105BC-0.318A2-0.243B2-0.493C2

表2 响应面分析方案与试验结果Table 2　Response surface analysis program with test results

表3　黑木耳蛋白质得率回归方差分析Table 3　Auricularia auricular protein yield regression analysis of variance

为了验证模型的有效性，进行了方差分析，结果见表3。由表3可知，影响显著因素为A、BC、B，极显著因素为C、A2、B2、C2，AB、AC影响不显著。在所选的各因素水平范围内，按照对结果的影响排序：C＞A＞B，即碱液浓度＞料液比＞提取时间。3个因素中，提取时间和碱液浓度之间存在较为显著的交互作用。由响应面分析得相关系数R2为0.989 0，说明黑木耳蛋白质得率的试验值与预测值之间有很好的拟合度。由表3方差分析的结果可以看出方程的失拟项不显著，表明该方程对试验拟合情况好，误差小，可用该回归方程代替试验真实点对结果进行分析和预测［21］。

2.2.2等高线和响应面分析

根据黑木耳蛋白质得率回归模型做出相应的二维等高曲线图与三维球面图，见图5～图7。

图5　提取时间和料液比对蛋白质得率的影响Fig.5　The effect of extraction time and temperature on protein yield

图6　碱液浓度和料液比对蛋白质得率的影响Fig.6　The effect of alkali concentration and solid-liquid ratio on protein yield

图7　碱液浓度和提取时间对蛋白质得率的影响Fig.7　The effect of alkali concentration and extraction time on protein yield

响应面曲面坡度反映该因素对蛋白质得率影响的强弱程度。等高线密度反映蛋白质得率的变化程度，密度越大，响应面越陡，密度越小，响应面越平。等高线的位置与形状反映交互作用的强弱，形状趋近于椭圆形表示两因素交互作用对蛋白质得率影响显著，形状趋近于圆形表示两因素交互作用对蛋白质得率影响不显著［22］。由图5、图6可知，随着提取时间、料液比碱液浓度的逐渐增大，蛋白质得率曲线呈先增加后降低趋势，存在最高点，观察图中曲面较平滑，等高线近似圆形，说明提取时间与料液比交互作用不显著。由图7可知，随碱液浓度的增加，蛋白质得率增幅非常明显且存在最高点，观察图中曲面较陡峭，等高线呈椭圆形，说明彼此之间交互显著，与方差分析结果一致。由此可知，适当增加提取时间、碱液浓度和料液比可提高其蛋白质得率。

2.2.3验证试验

根据响应面分析所得结果和二次多项式方程，利用Design-Expert软件计算出最佳提取条件为：提取温度50℃、料液比1∶93（g/mL）、提取时间2.57 h、碱液浓度0.0714 mol/L，此时预期蛋白质得率为4.54%。为便于操作，将上述条件参数进行修正为：提取温度50℃、料液比1∶90（g/mL）、提取时间2.5h、碱液浓度0.07mol/L。根据修正后的工艺条件进行3次验证试验，此时黑木耳蛋白质得率为4.52%，与理论值相比降低了0.44%，可见该模型较好地预测了试验结果。

3　结论

影响黑木耳蛋白质得率的主要因素为提取时间和料液比，其次为碱液浓度和提取温度，黑木耳蛋白质的等电点为pH3.5。在单因素试验的基础上，通过响应面试验优化得出黑木耳蛋白质提取最佳工艺条件，为便于操作将其修正为：提取温度50℃、料液比1∶90（g/mL）、提取时间2.5 h、碱液浓度0.07 mol/L。在此条件下，黑木耳蛋白质得率为4.52%。刘静波、王振宇等［11-12］采用传统水提法和酶法提取黑木耳蛋白质，产品得率仅为1.07%、2.6%，说明碱提酸沉法提取黑木耳蛋白质可以有效提高其得率，是提取黑木耳蛋白质较为适用的方法。

［1］刘雅静，袁延强，刘秀河，等.黑木耳营养保健研究进展［J］.中国食物与营养，201（10）：66-69

［2］Shui Guanghou，Wong Shih Peng，Leong Lai Peng.Characterization of antioxidants and change of antioxidant levels during storage of Manilkara zapotal［J］.Journal of Agricultural and Food Chemistry，2004（1）：52-26

［3］颜戊利，王林静.食用菌矿物质含量测定和营养评价［J］.食品科技，2010（7）：81-84

［4］郝文芳.黑木耳胶原蛋白的分离提取及其功能特性的研究［D］.哈尔滨：东北林业大学，2008，1-66

［5］杨春瑜，方迪，齐勇.黑木耳超微粉氨基酸和维生素含量变化及原因［J］.中国食用菌，2004（6）：33-35

［6］张琳.木耳的化学成分及药理作用研究 ［D］.长春：吉林农业大学，2013，1-50

［7］Tao Y Z，Zhang L N，Peter C K.Physicochemical properties and antitumor activities of water-soluble native and sulfated hyperbranched mushroom polysaccharides［J］.Carbohydrate Research，2006，341（13）：2261-2269

［8］朱雪琼.黑木耳多糖的提取、功能及单糖组成的研究［D］.南宁：广西大学，2014：1-86

［9］Hua Zhang，Zhen-Yu Wang，Lin Yang，et al.In Vitro Antioxidant Activities of Sulfated Derivatives of Polysaccharides Extracted from Auricularia auricular［J］.International Journal of Molecular Sciences，2011，12（5）：3288-302

［10］Zeng Feng，Zhao Chao，Pang Jie，et al.Chemical properties of a polysaccharide purified from solid-state fermentation of auricularia auricular and its biological activity as a hypolipidemic agent［J］. Journal of food science，2013（1）：78-79

［11］刘静波，赵颂宁，林松毅，等.酶解法提取黑木耳中胶原蛋白的工艺优化［J］.农业工程学报，2012，28（13）：282-286

［12］王振宇，郝文芳.超声波法提取黑木耳蛋白质的工艺研究［J］.生物质化学工程，2007（5）：25-27

［13］林莉，秦礼康，张伟.薏米糠蛋白的提取工艺优化及其功能性质［J］.食品科学，2015（2）：46-51

［14］施瑛，裴斐，周玲玉，等.响应面法优化复合酶法提取紫菜藻红蛋白工艺［J］.食品科学，2015（6）：51-57

［15］张艳萍，俞远志，戴志远.贻贝蛋白质的分级及提取工艺研究［J］.中国食品学报，2014（2）：78-84

［16］邓丽莉，潘晓倩，生吉萍，等.考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量的条件优化［J］.食品科学，2012（24）：185-189

［17］谢昊宇，贾冬英，迟原龙，等.青稞蛋白质碱法提取条件的优化研究［J］.食品工业科技，2014（18）：281-283，287

［18］Jianmei Yu，Mohamed Ahmedna，Ipek Goktepe.Peanut protein concentrate：Production and functional properties as affected by processing［J］.Food Chemistry，2007，103（1）：121-129

［19］王振斌，王玺，林晓明，等.响应面法优化芝麻饼粕蛋白的制备条件［J］.食品工业科技，2014（5）：167-171

［20］李加兴，向东，周炎辉，等.碱提酸沉法提取黄秋葵籽蛋白的工艺条件优化［J］.食品科学，2013（20）：23-26

［21］Ivo M Rodrigues，Jorge F J Coelho，M Gracam V S Carvalho.Isolation and valorisation of vegetable proteins from oilseed plants：Methods，limitations and potential［J］.Journal of Food Engineering，2012，109 （3）：337-346

［22］程晶，雷建都，刘静，等.响应面法优化人参叶总皂苷提取工艺的研究［J］.北京林业大学学报，2015（2）：142-147

Optimization of Alkali Extraction of Protein from Auricularia auricula

ZHAO Yu-hong1，LIN Yang1，ZHANG Zhi1，WANG Zhen-yu2，*
（1.College of Forestry，Northeast Forestry University，Harbin 150040，Heilongjiang，China；2.School of Chemical Engineering，Harbin Institute of Technology，Harbin 150090，Heilongjiang，China）

In order to optimize the extraction process of protein from Auricularia auricular，solid-liquid ratio，extraction time，temperature and alkali concentration were investigated for their effects.The optimal extraction conditions were explored by response surface methodology.The results showed that optimal protein extraction parameters were temperature 50℃，solid-liquid ratio 1∶90（g/mL），extraction time 2.5 h，alkali concentration 0.07mol/L.Under these conditions，the yield of protein from Auricularia auricular was 4.52%.The results indicated that this protein extraction method was distinctly effective when applied on Auricularia auricular.

Auricularia auricular；extraction；protein；response surface optimization

2015-09-25

黑龙江省应用技术研究与开发计划项目（GA13B202）

赵玉红（1968—），女（汉），副教授，博士，研究方向：林特产品精深加工。

王振宇，教授，博士，研究方向：植物活性物质及功能食品。