陆 琤　周晨辰　张鹏飞　张 硌*

构建原核表达质粒pGEX-4T-2-GFP并鉴定其在大肠杆菌中的表达*

陆 琤①周晨辰①张鹏飞①张 硌①*

目的：构建绿色荧光蛋白（GFP）的原核表达质粒，用以研究小鼠巨噬细胞吞噬细菌的能力。方法：编码GFP的聚合酶链反应（PCR）产物经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后，与双酶切后的载体pGEX-4T-2相连，将pGEX-4T-2-GFP转化E.coli DH5α提取质粒，经测序后转化E.coli BL21中诱导GST-GFP融合蛋白表达，将表达融合蛋白的大肠杆菌滴入培养巨噬细胞的皿中，于荧光显微镜下观察GFP的表达及大肠杆菌被吞噬情况。结果：获得的重组质粒测序正确。荧光显微镜下能清晰观察到培养基中及被巨噬细胞吞噬后发绿色荧光的大肠杆菌。结论：成功构建了pGEX-4T-2-GFP重组质粒，为研究小鼠巨噬细胞吞噬细菌的能力创造条件。

绿色荧光蛋白；pGEX-4T-2载体；重组质粒；表达；荧光显微镜

［First-author's address］ Department of Medical Engineering， The Affiliated Hospital of Military Medical Sciences，Beijing 100071， China.

绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一种在蓝色波长范围光线激发下，发出绿色荧光的蛋白［1］。GFP与传统的荧光抗体相比，其灵敏度高、无生物毒性，在酸、碱及加热等条件下稳定，荧光反应不需要任何外源反应底物，且其表达无物种或细胞组织的专一性，还可以消除因抗体与非靶位点相结合带来的背景荧光的干扰［2-3］。因此，GFP作为一种报告蛋白，在监测目的基因的表达、研究细胞内物质代谢及追踪细胞系的分化等方面有着极其广泛的应用［4-5］。

GFP的N-端或C-端可以和异质蛋白连接组成融合蛋白，既能保留异质蛋白的固有特性，又能保留GFP的发光能力，是良好的报告蛋白和荧光标记分子。因此，GFP融合蛋白实际上可作为一种“荧光标签”用来研究蛋白质在细胞中的定位、转移及相互作用等。……