白小英 王 燕 张云丽 曹云飞 张 伟*（青岛市海慈医疗集团中药制剂实验室，山东 青岛 266033）

超临界提取消癥软胶囊中莪术等药材的工艺研究

白小英 王 燕 张云丽 曹云飞 张 伟*
（青岛市海慈医疗集团中药制剂实验室，山东 青岛 266033）

目的 优选消癥软胶囊中三棱、莪术、香附、肉桂等四味药的超临界提取工艺。方法 采用正交试验设计，以挥发油和吉马酮提取率为指标，考察萃取温度、萃取压力和萃取时间三个因素对提取效果的影响。结果 在CO2流量16 mL/min、药材粒度为40目条件下，优选工艺为萃取温度45 ℃，萃取压力25 MPa，萃取时间1.5 h。结论 优选工艺三次验证试验，挥发油和吉马酮提取率均值分别为2.470%（g/g）和1.431 mg/g。样品提取率高，结果重复性好，提取工艺条件稳定可行。

消癥软胶囊；正交试验设计；超临界提取；挥发油；吉马酮

超临界CO2提取技术在中草药有效成分提取分离研究中已得到广泛应用，尤其对含亲脂性、低沸点成分的中草药明显优于传统提取、分离技术。为了充分提取活性组分，本实验以总挥发油和消癥软胶囊中君药之一的莪术主要药效成分吉马酮为指标，采用超临界CO2提取法，对影响萃取工艺的主要因素进行正交设计优化实验研究，为该制剂制备工艺提供科学依据。试验研究如下。

1　主要仪器、试剂与药材

SFT-2000 型超临界萃取设备（美国SFT公司）；Agilent 1100型高效液相色谱仪（自动进样器，四元低压梯度泵，柱温箱，紫外检测器；美国Agilent公司）；LE225D型电子分析天平（德国）；ABY-0502-1-U型艾科浦超纯水机（重庆颐洋企业发展有限公司）；吉马酮对照品（中国食品药品鉴定研究院；批号：11165-201204）；乙腈（色谱纯，美国TEDIA公司）；其余试剂皆为分析纯。三棱、莪术、香附、肉桂购自安徽广印堂中药股份有限公司，经鉴定均符合《中国药典》2015年版各自的药材标准，其中莪术为姜科植物温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎。

2　实验方法与结果

2.1吉马酮含量测定方法学考察

2.1.1色谱条件［1］：高效液相色谱仪：Agilent1100型高效液相色谱仪；色谱柱：Eclipse XDB-C184.6 mm×15 cm；流动相：乙腈∶水=80∶20；检测波长：210 nm；柱温：25 ℃；流速：1 mL/min；进样量：10 mL。

2.1.2对照品溶液的制备：精密称取吉马酮标准品5.62 mg于100 mL容量瓶中，用一定量的甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀，制成56.200 μg/mL的吉马酮对照品储备液溶液，备用。

2.1.3供试品溶液的制备：取超临界CO2提取药物（三棱、莪术、香附、肉桂），40 ℃鼓风干燥后，粉碎并过40目筛，准确称取1/3处方量的药物细粉。置超临界萃取釜中，设定CO2流量为14 mL/min，萃取压力为20 MPa，萃取温度为40 ℃，萃取时间为1.5 h，收集供试品提取液于2 mL量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀。取溶于甲醇后的提取液1 mL于25 mL容量瓶中加甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀。用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液备用。

2.1.4阴性样品溶液的制备：按处方方量取三棱、香附、肉桂按“2.1.3”项下方法制备阴性样品溶液。

2.1.5专属性实验：取供试品溶液、对照品溶液及阴性样品溶液，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，测定结果见图1。结果表明处方中其他药味不干扰吉马酮的测定，吉马酮的理论板数＞8000。

2.1.6线性关系考察：精密量取“2.1.2”项下的吉马酮对照品储备液1、3、5、7、9 mL分别置10 mL的容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，得系列对照品稀释液（吉马酮对照品溶液浓度分别为5.620、16.860、28.100、39.340、50.580 mg/mL），按“2.1.1”项下色谱条件注入高效液相色谱仪，测定并记录吉马酮对照品色谱峰面积，以吉马酮对照品浓度（X）为横坐标，峰面积积分值（Y）为纵坐标，进行线性回归，计算吉马酮对照品的回归方程为：Y=90.575X-39.050，（R2=0.999 6），见图2。结果表明吉马酮对照品在5.620～50.580 mg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系。

图1　吉马酮高效液相色谱图

图2　吉马酮线性关系考察

2.1.7精密度试验：精密量取吉马酮对照品溶液（56.200 mg/mL），按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6次，测得吉马酮峰面积，计算RSD 为1.130%（n=6）。表明该方法精密度良好。

2.1.8重复性试验：精密称取同一批样品6份，按“2.1.3”项下方法制备成供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，结果RSD为1.211%（n=6），表明样品重复性较好。

2.1.9稳定性试验：取“2.1.3”项下样品溶液适量，分别在室温放置0、2、4、8、10、12、24 h，按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，记录峰面积并计算RSD值为1.523%，表明样品溶液在24 h内稳定性良好。

2.1.10加样回收试验：取已知含量的提取物6份，分别精密加入高、中、低3个量的吉马酮对照品溶液，按“2.1.3”项下方法制备供试品溶液，并按“2.1.1”项下色谱条件进行测定，计算回收率。结果发现吉马酮的平均回收率为97.970%，RSD为1.409%。试验结果见表1。

2.2超临界提取工艺优化研究

2.2.1考察指标的选择：以超临界CO2提取率和消癥软胶囊组方药物中君药之一的莪术主要药效成分吉马酮为两个评价指标，各按50%的权重进行综合评价考察。

表1　超临界提取物加样回收试验结果（n=6）

2.2.2实验方案设计：以药材粒度40目、CO2流量16 mL/min，对萃取温度、萃取压力和萃取时间三个因素，按L9（34）正交设计方案进行实验。因素水平见表2，正交实验方案见表3。

表2　超临界CO2提取工艺因素水平表

2.2.3超临界流体萃取实验：按1/3处方量分别准确称取粉碎粒度为40目的三棱、莪术、香附及肉桂药物细粉共9份，装入超临界萃取仪的萃取釜内，在CO2流量在16 mL/min条件下，分别按表2实验方案进行萃取。收集提取物，4 ℃以下低温避光密闭保存。

2.2.4挥发油提取率测定［2］：将9份提取物置挥发油测定装置中，按《中国药典2015版》分别测定挥发油含量。

2.2.5吉马酮含量测定：将9份提取物各取约1 mL，精密称定，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解，并定容至刻度，摇匀。用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，分别吸取续滤液各5 μL，按“2.1.1”色谱条件进样、测定、计算吉马酮提取率，并对实验数据进行方差分析。结果见表3、4。

表3　超临界CO2提取工艺正交试验数据及其计算分析结果（n=3）

表4　超临界CO2提取工艺正交试验方差分析

2.2.6试验结果及分析：对表3、表4分析可知，影响超临界提取效果的因素顺序依次为：A（萃取温度）＞B（萃取压力）＞C（萃取时间），其中A因素对提取有非常显著影响（P＜0. 01），B因素有显著性影响（P ＜0.05），而C因素影响无显著性差异P＞0.05。最佳超临界提取工艺组合为A3B3C2。考虑到C因素对提取无显著性差异，优化工艺设定为A3B3C1组合，即萃取温度45 ℃、萃取压力25 MPa，萃取时间1.5 h。

2.2.7验证试验：按处方方量的1/3准确称取醋三棱、醋莪术、制香附及肉桂药粉（40目）3份，在CO2流量在16 mL/min条件下，根据优化提取工艺进行提取，验证试验结果见表5。验证试验结果表明，样品结果重复率高，所筛选出的工艺条件稳定可行，具有可操作性和重复性。

表5　超临界CO2提取工艺验证试验

3　结 论

本实验通过正交实验设计，以挥发油提取率和吉马酮两个指标各占50%的权重进行综合评分，对“消癥软胶囊”组方药物中的三棱、莪术、香附、肉桂四味药材的超临界提取工艺进行优选实验，优化工艺为药材粒度40目，CO2流量16 mL/min，萃取温度45 ℃，萃取压力25 MPa，萃取时间1.5 h。三次验证试验挥发油提取率均值为2.470% （g/g），RSD为1.579%；吉马酮均值为1.431 mg/g，RSD为1.470%。样品提取率高，结果重复性号，提取工艺条件稳定可行。

4　讨 论

“消癥软软胶囊”组方药物中的三棱、莪术、香附、肉桂四味药材均含有挥发油，君药莪术主要药效成分之一的吉马酮含量较高，有一定的抗肿瘤活性，有学者建议将吉马酮作为莪术质量评价指标纳入再版药典中［1］。因此用挥发油得率和吉马酮含量两项指标的综合评分，评价指标更能客观反映“消癥软胶囊”组方药物中莪术等药材的超临界提取工艺。

［1］ 杨木华，杨志文.莪术挥发油的提取工艺研究［J］.时珍国医国，2010，21（4）:914.

［2］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:四部［S］.2015版.北京:中国医药科技出版社，2015:203.

R282.710.3

B

1671-8194（2016）22-0035-03

青岛市2015-2016年度中医科研计划项目（课题编号：2015-zyy008）

E-mail： haicizw@126.com