高　强，李　明，李荣玉，郑　丽，胡贤峰



31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂制备及其对稻瘟病菌的抑制作用

高强1,2，李明2,3*，李荣玉2,3，郑丽1,2，胡贤峰2

(1.贵州大学 精细化工研究开发中心，贵州 贵阳 550025；2.贵州大学 作物保护研究所，贵州 贵阳 550025；3.贵州大学 贵州山地农业病虫害重点实验室，贵州 贵阳 550025)

为了提高柠檬醛的田间使用效果，进行了柠檬醛水剂的制备及其生物活性研究。通过不同乳化剂、渗透剂、防腐剂等助剂的优化筛选实验，确定了柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂的最优配方，并对制剂进行了室内生物活性测定。结果表明：柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂的最佳配方为31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精包合物、10%OP-15、5%渗透剂T、0.5%山梨酸钾、蒸馏水补足至100%；并且制剂的各项理化性能优良，符合水剂的质量技术指标。31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对水稻稻瘟病菌菌丝生长和孢子萌发均有较好的抑制作用，其EC50值分别为21.37、35.63 μg/mL。柠檬醛水剂的研制，为柠檬醛的田间使用提供一种方法。

柠檬醛；水剂；表面活性剂；水稻稻瘟病病菌

柠檬醛(citral)为开链单萜类有机化合物，主要存在于山苍子油、柠檬草油和枫茅油等植物精油中[1-3]，由于具有浓郁香气、天然无毒以及抗氧化活性，被作为防腐剂、芳香剂及调味剂等广泛应用在化妆品、食品工业等领域中[4-5]。近年来随着研究的不断深入，有关柠檬醛杀虫杀菌活性的报道日益增多，张文平等[6]研究发现，柠檬醛具有较高的抗黄曲霉活性；卢春等[7]研究表明，柠檬醛对水稻稻瘟病菌菌丝生长和孢子萌发均具有较好的抑制作用。因此，柠檬醛是一种极具有开发前景的无公害植物源杀菌剂。由于柠檬醛难溶于水，易溶入乙醇、乙醚、矿物油等有机溶剂，且理化性状不稳定，易挥发、氧化而失去生物活性，一般加工的制剂不稳定。本研究利用柠檬醛羟丙基-β-环糊精包合物的水溶性，将柠檬醛加工成水剂，加工工艺简单、损耗小、成本低。制剂的加工或施用对环境污染小，符合农药制剂环保型的要求，同时也适应当前农药剂型水基化的发展趋势，为柠檬醛的田间使用提供一种可行性方法。

1　材料与方法

1.1供试材料

1.1.1仪器AL104分析天平(梅特勒-托利多仪器有限公司)；恒温水浴锅(江苏金坛中大仪器厂)；超净工作台(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；立式压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)；HJ-6多头磁力加热搅拌器(金坛市盛蓝仪器制造有限公司)；数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司)；GXZ智能型培养箱(宁波江南仪器厂)；生物显微镜(宁波舜宇仪器有限公司)；移液枪(上海赛默飞仪器有限公司)；玻璃仪器：100、250 mL烧杯，250 mL具塞量筒，1、5、10 mL移液管。

1.1.2试剂柠檬醛(本实验室从山苍子精油中分离提取)；柠檬醛羟丙基-β-环糊精包合物(柠檬醛含量≥6.48%，本实验室制备)；表面活性剂：OP-15、NP-10、A-110、T-60、O-10、MOA-9、BY-140，渗透剂T、JFC-2(江苏省海岸石油化工厂)；防腐剂：苯甲酸钠、山梨酸钾、水杨酸钠(天津市科密欧化学试剂有限公司); 6%春雷霉素可湿性粉剂(华北制药股份有限公司)。

1.1.3供试病原菌水稻稻瘟病病菌ZB15(Magnaporthegrisea)采自田间自然发病水稻植株上的病菌，经本实验室分离、纯化、鉴定后保存备用。

1.2实验方法

1.2.1柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂配制方法

按照一定量的比例，将柠檬醛羟丙基-β-环糊精包合物、表面活性剂、助剂和水加入烧杯中，于磁力搅拌器上搅拌均匀，即得31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂[8-9]。

1.2.2理化性能测定

依据水剂的特点，分别测定制剂乳液的稳定性、pH值、冷贮和热贮稳定性等。

乳液稳定性测定：取1 mL制剂，用342 mg/L标准硬水稀释200倍于具塞量筒中，置于(30±1)℃恒温水域中1小时，上无浮油，下无沉淀为合格。冷贮稳定性测定：参照GB/T 19137-2003农药低温稳定性测定方法进行。热贮稳定性测定：参照GB/T 19136-2003农药热贮稳定性测定方法进行。起泡性实验：量取2.5 mL制剂于250 mL烧杯中，加入342 mg/L的200 mL标准硬水稀释、搅拌均匀，移入250 mL具塞量筒内，盖上塞子，上下颠倒30次，放置1 min，其液面泡沫低于60 mL为合格。pH值测定：参照GB/T 1601-1993农药pH值测定方法测定。渗透性测定：采用点样毛细管在水稻叶片上点样，根据不同渗透剂制剂在水稻叶片上展布的面积来确定渗透剂的渗透展着性能。

1.2.3柠檬醛水剂对水稻稻瘟病菌生物活性测定

采用菌丝生长速率法和孢子萌发抑制法测定柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂的杀菌活性[10-11]。PDA和米糠平板的制作参照卢春等的方法[7]，采用DPS软件进行数据分析，求出毒力回归方程y=a+bx和相关系数，并计算出柠檬醛水剂对稻瘟病菌的EC50值。

2　结果与分析

2.1表面活性剂筛选

确定水为溶剂，加入31%的羟丙基-β-环糊精包合物(柠檬醛的含量≥2%)，表面活性剂的含量为10%，以此为基本配方，配制出含不同表面活性剂的制剂。先进行冷贮，对冷贮合格的样品再进行热贮，冷、热贮合格者，即为所筛选的表面活性剂。不同表面活性剂所配制剂的冷热贮实验结果见表1。结果表明：有两种表面活性剂适用于柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂的配制，即OP-15、NP-10，相比冷、热贮的结果，OP-15表面活性剂最适用于柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂制备。

表1　不同表面活性剂制剂样品冷热贮实验效果

2.2渗透剂筛选

增效渗透剂能增加农药制剂中的农药活性物质在作用靶标上迅速展布、内吸，具有提高药效的作用。由表2可知，渗透剂T和JFC-2对水稻叶片都具有较好的展布、渗透效果，但渗透剂T的展布、渗透效果优于JFC-2。渗透剂T用量在5%、7%时，柠檬醛制剂在叶片上的展布直径差异不显著，故渗透剂的用量为5%为宜。

表2　渗透剂筛选

2.3防腐剂筛选

以苯甲酸钠、山梨酸钾、水杨酸钠作为防腐剂添加对象，在不同的添加量下，分别测定有效成分的分解率。结果表明：山梨酸钾有很好的防腐效果，能够有效降低柠檬醛的分解率，因此选用山梨酸钾作为制剂的防腐剂，山梨酸钾的添加量以0.5%为宜。

2.4柠檬醛水剂配方

根据以上配方筛选实验结果，优选31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂配方见表4。

表3　防腐剂筛选

表4　31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂配方

2.5柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂的理化性能

对柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂各项理化性能的测定。结果表明31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂各项理化性能指标均合格。实验结果见表5。

表5　31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂各项技术指标的测定

2.631%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对水稻稻瘟病菌生物活性

2.6.131%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用

采用菌丝生长速率法测定了柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用，其结果见表6。31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对稻瘟病菌菌丝生长有较好的抑制效果，其EC50为21.37 μg/mL，较柠檬醛原药和6%春雷霉素效果显著。

表6　31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对稻瘟病菌菌丝生长的抑制作用

2.6.231%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对稻瘟病菌孢子萌发的抑制作用

采用孢子萌发抑制法测定了柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对稻瘟病菌孢子萌发的抑制作用，其结果见表7。31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对稻瘟病菌孢子萌发的抑制效果较6%春雷霉素可湿性粉剂效果略低，其EC50值为35.63 μg/mL，较柠檬醛原药对稻瘟病菌孢子的生物活性略高，其主要原因在于柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂中的农药活性物质被包裹在羟丙基-β-环糊精的内腔，农药活性物质会以一定的速率持续稳定地向外释放到达作用靶标，柠檬醛水剂具有一定的缓释性，因此采用孢子萌发抑制法测定柠檬醛水剂生物活性的速效性较差。

表7　31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对稻瘟病菌孢子萌发的抑制作用

3　讨论

31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂外观为无色透明的均相液体，其pH值、稀释稳定性、冷贮、热贮稳定性等各项技术指标均符合农药水剂的要求。室内生测实验结果表明，2%柠檬醛水剂对水稻稻瘟病菌菌丝生长和孢子萌发均有较好的抑制效果，其EC50值分别为21.37、35.63 μg/mL。而柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂对稻瘟病菌孢子的抑制效果低于对菌丝的抑制效果， 其主要原因在于柠檬醛是以一定的速率持续稳定地向外释放，其速效性较差。因此，采用HP-β-CD对柠檬醛的包合，即增加了柠檬醛的水溶性，又提高了柠檬醛制剂稳定性和田间持效期。

柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂的制备工艺简便可行、杀菌效果好、成本低、环保安全，在制备的过程中以水为溶剂，即节省了大量的有机溶剂，降低了成本，又减少了有机溶剂对操作者的刺激和对环境的污染。因此，31%柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂属于水基化农药剂型的范畴，符合环保型农药制剂的要求。柠檬醛羟丙基-β-环糊精水剂的制备为柠檬醛的田间施用提供了一种可行性方法。

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Preparation of Citral HP-β-CD 31% AS and Its Biological Activity of Magnaporthe Grisea

GAOQiang1,2，LIMing2,3*,LIRong-yu2,3ZHENGLi1,2,HUXian-feng2

(1.ResearchandDevelopmentCenterforFineChemicals，GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 2.InstituteofCropProtection，GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China; 3.TheprovincialKeyLaboratoryforAgriculturalPestManagementinMountainousRegion，GuizhouUniversity,Guiyang,Guizhou550025,China)

To improve application effect of citral in the field,citral HP-β-CD 31% AS were prepared and its biological activity.In order to determine the optimal formula of citral HP-β-CD 31% AS and conducting different emulsifiers，penetrants，preservatives and other additives screening experiments，determination of biologically active of citral HP-β-CD 31% AS. The results showed that the optimum formulation are as follows:31% citral HP-β-CD inclusion complexes,10% OP-15,5% penetrant,0.5% potassium sorbate，distilled water were consisted in the optimum formulation.Its physical-chemical nature of preparation met the quality standard of aqueous solution. Citral HP-β-CD 31% AS have good inhibition for rice blast fungus mycelium growth and spore germination and its EC50values were 21.37、35.63 μg/mL.Its development for citral to provide a method of field use.

citral; aqueous solution(AS); surfactant;Magnaporthegrisea

2016-03-17；

2016-04-06

国家自然科学基金项目“柠檬酫对稻瘟病菌细胞壁靶位蛋白的影响及机制”(31460480)。

李明，男，教授，博士生导师，主要研究方向：植物源农药与应用技术；E-mail:lm21959@163.com 。

TQ450.6

A

1008-0457(2016)02-0029-05国际DOI编码：10.15958/j.cnki.sdnyswxb.2016.02.006