张 哲, 焦静雨, 陈 姣, 孟 强, 吴绵斌,2, 林建平, 杨立荣



重组大肠杆菌的构建及利用木糖生产木糖醇的研究

张 哲1, 焦静雨1, 陈 姣3, 孟 强3, 吴绵斌1,2, 林建平1, 杨立荣1

(1. 浙江大学生物质化工教育部重点实验室, 浙江大学化学工程与生物工程学院, 浙江 杭州 310027; 2. 浙江省 抗真菌药物重点实验室, 浙江 台州 318100; 3. 浙江海正股份有限公司, 浙江 台州 318100)

xylB基因失活可以降低木酮糖的磷酸化，使木糖还原为木糖醇而不进入PPP途径。利用Red重组技术构建xylB缺失大肠杆菌DxylB/BL21(DE3)可以提高木糖醇的产率。 通过PCR克隆得到来自的木糖还原酶基因xr, 将该基因与载体pET30a(+)连接构建表达质粒pET30a-xr；PCR克隆得到来自K-12的6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶(6-phosphogluconate dehydrogenase，6-PGDH)基因gnd和葡萄糖6-磷酸脱氢酶(glucose-6-phosphate dehydrogenase，G6PDH)基因zwf，依次与双启动子原核表达载体 pCDFDute-1连接构建表达质粒pCDFDuet-gnd-zwf；将上述构建好的两个重组质粒同时转化到DxylB/BL21(DE3) 宿主体内。经异丙基---硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达获得分子量约为38、51、54 kD的三种蛋白，酶活测定显示，重组菌种XR的比酶活为7.25 U×mg-1，6-PGDH的比酶活为2.26 U×mg-1，G6PDH的比酶活为1.31 U×mg-1。5 L发酵罐发酵结果显示，xylB基因敲除可以提高木糖醇的产率，含NADPH再生系统的菌株木糖醇的体积产率是1.04 g×(L×h)-1，比只含有木糖还原酶的重组菌株0.88 g×(L×h)-1高24.32%，为后续工业化利用大肠杆菌生产木糖醇奠定了基础。

xylB 基因；xr基因；gnd 基因；zwf 基因；木糖醇

1 前 言

木糖醇为五碳糖醇，分子式为C5H12O5，白色结晶状，溶解度等理化性质与蔗糖很相似，是木糖代谢的正常中间产物，广泛存在于自然界中，在化工、食品、医药等工业中有着广泛应用[1,2]，木糖醇是人体糖类代谢的中间体，食用后不消耗胰岛素，并且木糖醇具有特殊的防龋功能，可做糖尿病人的营养剂、治疗剂及儿童防龋食品，同时木糖醇还具有降低血糖浓度[3]、促进钙吸收[4]等多种功能。……