彭 清, 姚 忠, 周 治, 王浩绮, 肖 环, 倪 芳, 孙 芸



定点突变提高-谷氨酰转肽酶的pH耐受性及催化活性

彭 清, 姚 忠, 周 治, 王浩绮, 肖 环, 倪 芳, 孙 芸

(南京工业大学 食品与轻工学院, 江苏 南京 211816)

-谷氨酰转肽酶(GGT)是生物体内谷氨酰循环的关键酶,可广泛应用于多种-谷氨酰基化合物的生物合成。但其在体外催化环境下(pH>9.0)极易发生不可逆失活，限制其生物催化领域的实际应用。本实验以枯草芽孢杆菌NX-2 GGT(_GGT)为对象，采用同源建模获得_GGT的3D结构预测模型；分析_GGT大、小亚基表面氨基酸残基的性质、空间位置和保守性，最终选取Asp46、Thr201、Tyr280、Gln322、Glu502和His543为候选位点；通过定点突变将候选位点分别替换为缬氨酸，以期通过提高_GGT大小亚基间的疏水作用，改善其pH耐受性。研究成功实现了6种突变酶(D46V、T201V、Y280V、E502V、Q322V和H543V)的异源表达，并分别研究了其催化活性和稳定性。结果表明：D46V、Y280V、E502V、H543V的m略小于_GGT，且Y280V的cat较_GGT有明显提高；D46V、Y280V和E502V的pH稳定性均较_GGT有所改善，其中Y280V的pH稳定性最高；模型分析显示，在<10Å范围内，Y280V可与附近4个氨基酸残基(Y-283、W-277、I-501和I-497)产生疏水相互作用，这可能是其pH耐受性较强的主要原因。

γ-谷氨酰转肽酶；定点突变；疏水相互作用； pH稳定性；催化性质

1 前 言

-谷氨酰转肽酶(-glutamyltranspeptidase，GGT，EC 2.3.2.2)是生物体内谷氨酰循环的关键酶，广泛存在于细菌、真菌、植物、哺乳类动物中。成熟的GGT是一种异质二聚体酶[1]，包含一个大亚基(~40 KDa)和一个小亚基(~20 KDa)，是由一个大小约60 KDa的没有催化活性的蛋白前体自主催化分裂而来[2]。

GGT可特异性催化谷胱甘肽的-谷氨酰基断裂， 将其转移至受体分子(如水分子、-氨基酸或二肽)[3]。由于该反应具有位点特异性强，且不消耗ATP等优点，在生物有机合成领域应用广泛。目……