李 红，易建中，刘成倩，严华祥*（上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海　006；上海佳牧生物制品有限公司，上海　006）

种蛋感染蜡状芽孢杆菌的分离鉴定及其药敏试验

李 红1，2，易建中1，刘成倩1，严华祥1*
（1上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海201106；2上海佳牧生物制品有限公司，上海201106）

通过生化试验、序列分析和药敏试验等方法，研究了19日龄鸡胚中细菌的存在情况及其耐药性。结果表明：经NCBI Blast比对确定分离的5个菌株均为蜡状芽孢杆菌，与GenBank上登录的蜡状芽孢杆菌KF150385、JX566534、KF475814菌株高度同源，同源性高达99.4%；5株分离菌株间也高度同源（99.9%）。药敏试验结果发现：5株蜡状芽孢杆菌对环丙沙星、麦迪霉素、丁胺卡那、红霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、诺氟沙星、氧氟沙星敏感，对多黏霉素B、复方新诺明、青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定具有耐药性。

鸡胚；蜡状芽孢杆菌；分离鉴定；16S rRNA；药敏试验

影响种蛋孵化率除了遗传因素还有种蛋因素，如蛋的破损与畸形、蛋壳的清洁消毒等，其中细菌性因素是影响孵化率的重要因素之一。传统的细菌鉴定方法是对细菌进行纯培养，然后从形态特征、生化特性及免疫学特性等方面进行鉴定。细菌作为单细胞生物，具有多态性，易变异，导致某些生化反应不稳定，且受临床抗生素使用的影响，有些菌株仅依靠形态和生化反应难以准确鉴定［1］。在利用传统方法鉴定细菌时经常遇到一些不能鉴定到种的菌株，而这些菌株对临床诊断或流行病学研究具有重要意义。因此，需要借助其他方法对其进行准确鉴定。16S rRNA基因是细菌染色体上与编码 rRNA相对应的dNA序列，长约1.5 kb，存在于所有原核微生物中，但不存在于真核生物及病毒中，在进化过程中高度保守，被称为细菌的“分子化石”，可用于研究不同生物物种间的亲缘关系。同时其保守性又是相对的，在保守区存在着9—10个变异区（V1—10），不同的科、属、种间均有不同程度的差异，故又可作为细菌分类鉴定的靶分子［2］。

目前，临床上通常采用形态观察和生化试验鉴定病原细菌，较少采用遗传学分析法。本研究运用16S rRNA基因序列分析鉴定19日龄鸡胚中细菌的存在情况及其耐药性，以期为鸡场的检疫及净化工作提供参考。

1　材料与方法

1.1材料

鸡胚采集于上海家禽育种有限公司种鸡场；大肠杆菌（Escherichia coli）Trans1-T1 Phage Resistant感受态细胞购于北京全式金生物技术有限公司。

1.2主要试剂

PCR纯化试剂盒、克隆载体pEASY-T1均购自北京全式金生物技术有限公司；Ex TaqdNA聚合酶购自TaKaRa生物工程公司；药敏片购于杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3样品的处理

在超净工作台上，将采集的19日龄鸡胚20枚放于紫外灯下杀菌30 min，然后用无菌酒精棉球擦拭整个蛋壳，用无菌的镊子打开鸡蛋外壳，用灭菌的棉拭子蘸取鸡胚内容物，将棉拭子放入缓冲蛋白胨水内进行增菌培养。有5个鸡胚长菌，取菌液于LB平板上划线培养，获取单菌落。

1.416SrRNA PCR扩增与测序

PCR反应的通用引物序列参照文献［3］，目的片段长为1500bp。引物由上海捷瑞生物技术有限公司合成，序列如下：27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增体系为50μL，引物浓度为0.2μmol/μL，Taq聚合酶浓度为0.025 U/μL。反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性40s，50℃退火40s，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min。利用PCR回收试剂盒回收PCR产物，将回收产物连入pEASY-T1克隆载体，利用F13通用引物（M13 Forward Primer：ACTGGCCGTCGTTTTAC；M13 Reverse Primer：GTCATAGCTGTTTCCTG）筛选阳性菌落，进行测序。

1.5序列分析

将测序结果导入NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的Blastn在线软件，选择Nucleotide Collection（nr/nt）数据库，运行Blastn程序，获取与该16S rRNA基因序列同源的序列和对应的细菌名称。相似度大于99%的细菌判定为同种细菌，相似度介于95%—99%判定为同属；相似度在91%—95%判定为同科［4］。

1.6生化试验

取菌液分别接种到葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇、果糖培养基中进行糖发酵试验；接种到MSP斜面、葡萄糖蛋白胨水、蛋白胨水、硝酸盐和淀粉培养基进行生化特性测定，接种后，放入37℃温箱，培养48 h，观察试验结果。

1.7药敏试验

对鸡胚中检出的菌采用纸片扩散法进行药敏试验，选择常用抗菌药物相对应的药敏纸片。按照中华人民共和国卫生行业标准（WS/T 125—1999）对结果进行判断。

图1　鸡胚培养液　PCR检测结果Fig.1　PCRdetection result of chicken embryo culture fluid

2　结果与分析

2.1鸡胚内容物的培养

20个19日龄鸡胚打开后，发现有1个鸡胚已经死亡。将鸡胚内容物放入37℃进行增菌培养24 h后，发现20个鸡胚中有5个鸡胚（A、B、C、D、E）有细菌生长繁殖，其中1个为死亡鸡胚。有菌的鸡胚，划线获取单菌落，每个平板分别挑取4个单菌落，进行 PCR鉴定。如图 1所示，A鸡胚中1、2号为阳性菌落；B鸡胚中1、2号为阳性菌落；C鸡胚中3号为阳性菌落；D鸡胚中2、3、4为阳性菌落；E鸡胚中1、2、4为阳性菌落。A、B、C、D、E鸡胚中的所谓非阳性菌落似乎也有条带，存在以下可能：可能是邻近阳性孔样品检测液流入导致微弱条带；可能是含菌量太低，扩增后条带比较弱。为了避免假阳性以及减少检测成本，PCR弱阳性的没有进行载体构建，以及后续的测序工作。

2.216SrRNA PCR扩增与测序

利用16SrRNA通用引物对单菌落进行PCR扩增鉴定，在1500bp左右扩增出特异性带，利用PCR回收试剂盒回收PCR产物，回收产物连入pEASY-T1克隆载体，利用F13通用引物筛选阳性菌落（A鸡胚中1、2菌液；B鸡胚中1、2号菌液；C鸡胚3号菌液；D鸡胚中2、3、4号菌液；E鸡胚中1、2、4号菌液）进行测序。将测序结果导入NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）的Blastn在线软件，选择Nucleotide Collection（nr/nt）数据库，运行Blastn程序，获取与该16S rRNA基因序列同源的序列和对应的细菌名称，比对结果显示与蜡状芽孢杆菌同源性最高。将序列导入DNAstar软件，与NCBI中同源性最高的蜡状芽孢杆菌（JX566534、KF150385、KF475814）序列进行比对，结果如图2所示。

图2　鸡胚菌与3株蜡状芽孢杆菌序列比对结果Fig.2　Sequence comparison results of the bacteria in chicken embryos and 3strains of Bacillus cereus

2.3比对细菌16S rRNA基因序列同源性

将序列导入DNAman软件，分析得出5个菌株的16S rRNA基因序列同源性在99.9%左右；将序列导入ClustalX软件，在菜单中选择Alignment-Do Complete Alignment，得到细菌的16S rRNA基因序列同源性比对结果。A（1，2）、B（1，2）、C（3）、D（2，3，4）、E（1，2，4）序列比对如图3所示，其中序列不一致的位置标在括号中注出。测序结果B-1和B-2相同，因此序列同源性比对时，只选择B-1进行比对。

图3　鸡胚内细菌核苷酸同源性比对结果Fig.3　Nucleotide homology comparison results of the bacteria in chicken embryos

2.4分离培养

蜡状芽孢杆菌在有氧或无氧的条件下均能生长，无氧比有氧生长好。1）菌落形态：在普通琼脂平板培养基上，37℃培养24 h，可形成圆形或近似圆形、质地软、无色素、稍有光泽的白色菌落，直径5—7 mm。2）个体形态：将分离培养和纯培养的培养基制片，作革兰氏染色，可见单个散在或形成3—5链状排列，有偏端芽孢，菌体两端钝圆，为革兰氏阳性较大的短杆状菌落（图 4）。3）液体培养性状结果：蜡状芽孢杆菌在液体培养基中呈均匀分化混浊生长，培养24 h后，形成小块状沉淀，沉于管底，振摇不散。

2.5生化试验

蜡状芽孢杆菌能分解葡萄糖、麦芽糖、半乳糖、蔗糖、木糖、阿拉伯糖、甘露醇、果糖并产酸，不能分解乳糖。硝酸盐还原试验、甲基红试验、淀粉水解酶试验、接触酶试验、VP均为阳性，吲哚试验为阴性（表1）。

图4　蜡状芽孢杆菌镜检结果（×1 000倍）Fig.4　Microscopic examination result of Bacillus cereus（×1 000 times）

2.6药敏试验

鸡胚中分离的菌为蜡状芽孢杆菌，对环丙沙星、麦迪霉素、丁胺卡那、红霉素、新霉素、卡那霉素、庆大霉素、诺氟沙星、氧氟沙星敏感，但对多黏霉素B、复方新诺明、青霉素、氨苄西林、头孢氨苄、头孢拉定具有耐药性。

表2　不同抗生素对蜡状芽孢杆菌的耐药程度Table 2　Resistance ofdifferent antibiotics to Bacillus cereus

3　结论与讨论

近40年来，抗生素、激素、防腐剂等药物性饲料添加剂在动物饲养中的广泛应用有力地促进了动物饲养业的发展，但近年来研究发现，药物性添加剂的普遍应用给人们带来了难以克服的弊端。美国食品和药物管理局公布了42种安全的益生菌，主要为乳酸杆菌、芽孢杆菌，酵母菌等［5］。蜡状芽孢杆菌作为饲料添加剂已经在多种动物饲养实验中应用。不论在畜禽养殖业，还是水产养殖业中的使用，都取得了乐观的效果［6］。为搞清楚本研究中蜡状芽孢杆菌是否为有益蜡状芽孢杆菌，下一步可开展培养基适应性、温度适应性、耐酸碱性、代谢产物测定以及动物试验。若其为优良的蜡状芽孢杆菌，可以考虑作为饲料添加剂替代激素、抗生素、防腐剂。

蜡状芽孢杆菌是广泛分布于土壤、水、空气、植物、饲料和各种食品的好气、中温、产芽孢的杆菌。该菌常处于孢子和休眠状态下，极易污染食物；一般不致病，但有的菌株可引起食物中毒［7-8］。该菌具有耐高温（100℃）、耐酸碱、耐挤压和耐受颗粒饲料加工的影响等特点，因此在饲料中可长期存在，一旦有致病菌株污染饲料，其孢子进入肠道后，便能迅速在肠道上部复活（复活率接近100%）［9］，对畜禽的健康构成潜在威胁。最近研究表明，该菌在自然情况下可引起牛的乳房炎、骆驼的“脓疱病”［10］、犬和猪的腹泻等；在特定的条件下也可引起人急性发作的呕吐综合征及与其他食物引起的慢性腹泻综合征［11］。蜡状芽孢杆菌污染的饲料和各类食品大多无腐败变质现象，在组织和感官鉴定时，除米饭有时微发粘或入口不爽外，大多数食品均表现为完全正常的感官性状，往往易被人们所忽视。本研究检测到鸡胚中存在蜡状芽孢杆菌，鸡胚的死亡是否是蜡状芽孢杆菌引起，还有待于进一步确证。鸡胚中蜡状芽孢杆菌的存在是饲料中存在的，还是外界污染造成的，或是鸡肠道内存在蜡状芽孢杆菌而导致鸡蛋的污染，还有待于进一步的研究。细菌性因素是影响孵化率的一个重要因素，因此，要做好鸡场的检疫及净化工作。

科学合理地用药是减少细菌产生耐药性最有效的方法。所以，应尽量提高对疾病诊断的准确率，减少不必要的用药，并严格用药剂量和疗程；加强对细菌耐药性的监测，为大多数养鸡场（户）的用药提供科学依据。

［1］张守印，李振军，张集，等.16S rRNA基因序列分析在非典型菌株鉴定中的应用［J］.中国卫生检验杂志，2008，18（4）：616-617.

［2］GRAY M W，SAONKOFFd，CEDERGREN R J.On the evolutionarydescent of organisms and organelles：aglobal phylogeny based on a highly conservedstructural core insmallsubunitribosomal RNA［J］.Nucleic Acids Res，1984，12（14）：5837-5852.

［3］BOSSHARD P P，ZBINDEN R，ABELSs，et al.16S rRNAgenesequencing versus the API 20 NEsystem and the VITEK 2 ID-GNB card for identification of nonfermentinggramnegative bacteria in the clinical laboratory［J］.J Clin Microbiol，2006，44（4）：1359-1366.

［4］FOXg E，MAGRUM L J，BALCH W E，et al.Classification of methanogenic bacteria by 16S ribosomal RNA characterization［J］.Proc Natl Acadsci USA，1977，74（10）：4537-4541.

［5］王丽娟.益生菌的研究及其应用进展［J］.饲料博览，1999，11（1）：15-18.

［6］黄丽彬，陈有荣，齐凤兰.蜡状芽孢杆菌在饲料中的应用［J］.粮食与饲料工业，2001（9）：32-33.

［7］董永胜，许军.甜高粱秸秆固态发酵生产燃料乙醇的工艺研究［J］.酿酒，2007，34（4）：49-51.

［8］杨佐毅，李理，刘冬梅，等.白腐乳中蜡状芽孢杆菌的分离与鉴定［J］.中国酿造，2008（17）：39-47.

［9］黄丽彬，陈有荣，齐凤，等.蜡状芽孢杆菌在饲料中的应用［J］.粮食与饲料工业，2001（9）：32-33.

［10］魏建功，王梅岩，蔡妙英，等.蜡状芽孢杆菌对骆驼的致病性的研究［J］.中国兽医杂志，1990，16（4）：10-11.

［11］BBI.Internationnalstatus of largescale production and use of fuel ethanolin in Brazil［C］.Beijing World Fuel Ethanol Congress，2001.

（责任编辑：闫其涛）

Isolation，identification anddrugsensitivity test of hatching eggs infected Bacillus cereus

LI Hong1，2，YI Jian-zhong1，LIU Cheng-qian1，YAN Hua-xiang1*
（1Institute of Animal Husbandry&Veterinaryscience，Shanghai Academy of Agriculturalsciences，Shanghai 201106，China；2Shanghai Jiamu Biological Products Company Limited，Shanghai 201106，China）

The existingsituation anddrug resistance of bacteria in 19day old chicken embryos werestudied by biochemical test，sequence analysis anddrugsensitivity test.The resultsshowed that the 5strains were identified as Bacillus cereus by NCBI Blast comparison，and had highly homologous（99.4%）with KF150385，JX566534 and KF475814strains registered ingenBank，and the 5strains were highly homologous（99.9%）also.drugsensitivity test resultsshowed that the 5 Bacillus cereusstrains weresensitive to ciprofloxacin，medemycin，amikacin，erythromycin，neomycin，kanamycin，gentamicin，norfloxacin，ofloxacin，and resistant to polymyxin B，compoundsulfamethoxazole，penicillin，ampicillin，cefalexin，cefradine.

Chicken embryo；Bacillus cereus；Isolation and identification；16S rRNA；Drugsensitivity test

S852.6

A

1000-3924（2016）04-087-05

2015-09-17

上海市科技人才计划（14YF1414600）

李红（1983—），女，博士，助理研究员，主要从事动物分子生物学和免疫学的研究。Tel：021-62204612，E-mail：lihong20061029 @163.com

严华祥（1966—），男，博士，研究员，研究方向：蛋鸡育种与鸡蛋安全。Tel：021-62205472，E-mail：yansafety@qq.com