丁艳平,孟　媛,张晋平,邵宝平

(1.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州　730070；2.兰州大学生命科学学院，甘肃兰州　730000)



OrexinA在牦牛和黄牛消化道中的表达差异

丁艳平1,孟媛1,张晋平1,邵宝平2

(1.西北师范大学生命科学学院，甘肃兰州730070；2.兰州大学生命科学学院，甘肃兰州730000)

通过分析促食欲素A(OrexinA)在牦牛和黄牛消化道不同部位的分布特征及表达差异，探讨OrexinA对牦牛能量代谢的调节作用.运用免疫组织化学SP法检测OrexinA在牦牛和黄牛胃肠道的表达，利用Image-ProPlus6.0软件对其表达强度进行半定量分析.结果表明，OrexinA在牦牛和黄牛的皱胃、幽门、贲门和十二指肠均有表达，但表达特征不同；牦牛胃和十二指肠中OrexinA阳性反应产物极显著地低于黄牛(P<0.01)；牦牛胃肠道中OrexinA阳性反应产物的吸光度分布为：皱胃区>幽门区>贲门区>十二指肠区(P<0.01).推测牦牛通过胃肠道OrexinA的低表达，调节中枢及外周组织的激素水平，从而维持机体能量代谢水平，适应青藏高原的特殊环境.

OrexinA；消化道；牦牛；黄牛

牦牛(Bos grunniens)是唯一适应青藏高原高寒、低氧、枯草期漫长等极端生态环境的半放野大型草食动物，其枯草期长达约8个月[1].促食欲素(Orexin)是由下丘脑外侧区(LHA)合成和分泌的小分子神经肽[2].Orexin家族有两个亚型，即OrexinA和OrexinB，OrexinA具有调节动物的摄食摄水行为、内脏活动及能量代谢等广泛的功能[3].已有报道，不同物种间OrexinA的结构保守、功能相似，但在不同消化道不同部位的分布具有种间差异性[3-6]，这种差异决定了动物的摄食和代谢等生理特性.以往关于Orexin的研究主要集中于人或大小鼠等实验动物[7-8].尚未见在牦牛消化道的相关研究.本研究以黄牛为对照，通过分析OrexinA在牦牛和黄牛消化道不同部位的分布特征及表达差异，探讨OrexinA参与其食欲、能量代谢等生理活动的作用机制，为进一步研究青藏高原土著动物对极端生境适应的能量代谢调控提供参考.

1　材料和方法

1.1组织采集与处理

牦牛组织样品于2014年10月取自甘肃玛曲屠宰场(海拔约3 500m)，黄牛组织样品于2014年10月取自甘肃临夏屠宰场(海拔约1 300m).牛处死后立即取皱胃、贲门、幽门和十二指肠组织，生理盐水清洗干净后，用40g·L-1多聚甲醛固定液固定，4 ℃冰箱保存.

1.2免疫组织化学染色

上述固定的牦牛、黄牛的贲门、皱胃、幽门、十二指肠，行常规石蜡切片，片厚5μm.贴于用多聚赖氨酸处理好的载玻片上，参考文献[9]采用SP法检测贲门、皱胃、幽门、十二指肠中OrexinA蛋白的表达.切片经梯度酒精脱蜡，枸橼酸盐热修复，3%过氧化氢以消除内源性过氧化物酶，山羊血清封闭后，滴加兔抗OrexinA多克隆抗体(稀释度：1∶200，武汉博士德生物工程有限公司)，阴性对照以PBS代替一抗，4 ℃过夜，用免疫组织化学试剂盒(SP-9001，北京中杉金桥生物技术有限公司)进行二、三抗孵育，DAB显色(ZLI-9018，北京中杉金桥生物技术有限公司)，苏木精复染，中性树胶封片.Olympus光学显微镜下区分观察贲门区、皱胃区、幽门区、十二指肠区，观察免疫阳性反应产物的表达.

1.3数据统计

2　结果

牦牛和黄牛的胃是复胃，包括瘤胃、网胃、瓣胃和皱胃.贲门为胃上端的入口，幽门为胃的远端，续接十二指肠.免疫组化结果表明，在牦牛和黄牛的皱胃、幽门、贲门和十二指肠中均有OrexinA阳性反应产物的表达，但其表达特征不尽相同.

2.1牦牛和黄牛消化道不同部位OrexinA的分布

2.1.1OrexinA在贲门区中的表达 牦牛贲门组织分黏膜层、黏膜下层、肌层和浆膜层.OrexinA的免疫反应产物主要表达于黏膜层贲门腺的壁细胞胞质内，壁细胞(Parietalcells，PC)胞体呈卵圆形，核大且呈椭圆形，位于细胞中部.其中贲门腺(Cardiacgland，CG)分为深、浅两层，浅层腺为单管腺，开口于胃小凹.贲门腺导管呈长梭形，由单层矮柱状细胞围成；深层腺为复管泡状腺，导管呈圆形，深层腺被结缔组织分成许多腺小叶，腺小叶体积较大，多呈椭圆形(图1A1)，腺泡由单层立方细胞围成，核呈圆形，位于细胞中央.黄牛贲门区的组织特点与牦牛相似，但其浅层腺泡较小，而且OrexinA的表达高于牦牛(图1A2).

2.1.2OrexinA在皱胃体中的表达牦牛和黄牛的皱胃中存在大量的免疫反应阳性细胞，位于黏膜层胃腺的颈部和底部细胞的细胞质中，细胞呈圆形、卵圆形，细胞核明显(图1B1).黄牛皱胃OrexinA的表达量明显高于牦牛(图1B2).

2.1.3OrexinA在幽门区中的表达牦牛幽门区的固有层内分布大量幽门腺，此区的胃小凹很浅，为多分支的管状粘液性腺，细胞多呈锥形，核为椭圆形，位于细胞基底部.牦牛幽门腺被结缔组织分为多个小叶.腺泡多为圆形或卵圆形，腺腔较大(图1C1).与牦牛相比，黄牛腺泡的体积比牦牛大，但是腺泡的数量明显少于牦牛(图1C2).牦牛和黄牛的OrexinA阳性表达均主要位于腺细胞的细胞质.

2.1.4OrexinA在十二指肠区中的表达在十二指肠中，牦牛的OrexinA阳性细胞主要分布于腺体细胞中，在其他固有层细胞(如肌肉细胞)中也散在分布(图1D1).黄牛十二指肠内OrexinA的表达部位与牦牛相同，但是表达量明显高于牦牛(图1D2).

2.2牦牛和黄牛OrexinA的免疫组织化学检测结果对比分析

免疫组织化学图像分析结果如表1所示，在牦牛和黄牛的胃肠道中，OrexinA阳性反应产物的平均吸光度从高到低依次为：皱胃体>幽门区>贲门区>十二指肠区(P<0.01)；黄牛贲门、皱胃、幽门和十二指肠OrexinA阳性反应产物的平均吸光度显著高于牦牛的相应部位的表达(P<0.01).

表1　牦牛和黄牛贲门、皱胃、幽门、十二指肠的Orexin A阳性反应产物的平均吸光值

注：*P<0.05为差异显著；**P<0.01为差异极显著.

A1,B1,C1,D1分别为OrexinA在牦牛贲门、皱胃、幽门、十二指肠中的表达；A2,B2,C2,D2分别为OrexinA在黄牛贲门、皱胃、幽门、十二指肠中的表达；标尺为40μm

A1,B1,C1,D1istheexpressionofOrexinAinthecardia，abomasums，pyloriandduodenumrespectivelyinyak；A2,B2,C2,D2istheexpressionofOrexinAinthecardia，abomasums，pyloriandduodenumrespectivelyincattle.Thebaris40μm

3　讨论

有研究表明，在人、猴、猪、绵羊、犬、猫、大鼠等动物中OrexinA神经元胞体的分布存在种间差异，但主要分布在下丘脑外侧区，其纤维广泛地投射于其他脑区和脊髓[3,10-13].Orexin及其受体也广泛存在于不同物种的外周器官，其表达细胞主要为内分泌细胞，如胸交感干神经节、胃、肠、甲状腺、胰腺、肾脏、肾上腺、胎盘、睾丸、附睾、胎盘等[14-15].OrexinA不仅在外周器官有广泛的调节作用，而且在中枢也参与对胃肠道生理活动的调节.本研究表明，OrexinA阳性细胞在牦牛和黄牛的网胃和瓣胃均未表达，而在牦牛和黄牛的皱胃壁细胞、幽门、贲门和十二指肠的腺细胞均有表达，但其表达特征和表达量不同，其中在幽门部，牦牛OrexinA在腺细胞表达较黄牛少，而在腺细胞外表达较黄牛多，推测其肽能神经末梢释放的递质在神经丛的传递中存在种间差异.

本研究表明牦牛胃组织和十二指肠中OrexinA阳性反应产物的平均吸光度极显著地低于黄牛，这可能与Orexin参与机体摄食、能量代谢、心血管节律性、神经内分泌等密切相关.有研究发现Orexin可促进动物摄食，给雄鼠侧脑室快速注入OrexinA能使动物呈现剂量依赖性促进摄食[3]；给断奶1周的小猪注射OrexinB，其采食量比对照组增加了18%[16].Orexin也参与神经内分泌的调节，肾上腺切除的大鼠PerpororexinmRNA的水平显著下降，当给予地塞米松时,可以恢复到正常水平，表明Orexin参与对下丘脑一垂体一肾上腺(HPA)轴的调节[17]，可能在应激反应中起重要的作用.Oerxin对内脏活动也有影响，给予大鼠不同剂量的OrexinA能依赖性促进其胃酸的分泌，阿托品或切断迷走神经就可以抵消这种作用[18]，表明OrexinA通过迷走神经以剂量依赖方式影响大鼠胃酸分泌，推断OrexinA可能是调节前期胃酸分泌的神经递质.而Orexin神经纤维投射到与心血管活动调节有关的脑干区，充分表明Orexin参与心血管活动的调节，脑室内注射OrexinA能使麻醉大鼠平均动脉压和心率升高[19].研究表明下丘脑Orexin神经元通过响应外周血液葡萄糖、瘦素以及胃饥饿素的代谢信号能直接感受有机体的营养状况，而且通过自主神经系统调节糖类物质的利用，表明Orexin可能是作为一个主调节器来调节中枢与外周组织的激素水平，进一步维持整个机体的能量代谢平衡[20].牦牛生活在青藏高原高寒地带，牧草生长季只有4—5个月，而枯草季长达7—8个月.笔者采样是在10月下旬，已经进入枯草期，这时牦牛下丘脑OrexinA神经元能精确地感应到外周组织的不良营养状况，所以分泌的OrexinA减少，借以通过改变自主神经平衡来调节机体能量代谢的平衡.而黄牛是圈养家畜，不存在食物短缺的现象，故其体内OrexinA的表达没有明显的变化.

综上所述，OrexinA在牦牛和黄牛的皱胃、幽门、贲门和十二指肠均有表达，而在枯草季节，放养的牦牛由于食物短缺，可通过减少OrexinA来调节中枢及外周组织激素水平，从而维持机体能量代谢水平，适应青藏高原的特殊环境，但其具体调控机理有待进一步的研究.

[1]张容昶.中国的牦牛[M].兰州：甘肃科学技术出版社，1989.

[2]OLSENSJ.Fossilancestryoftheyak，itsculturalsignificanceanddomesticationinTibet[J].Proceedings of the Academy of Natural Sciences of Philadelphia，1990，142(4):73.

[3]SAKURAIT.Theroleoforexininmotivatedbehaviours[J].Nat Rev Neucosci，2014，15(11):719.

[4]SAKURAIT，AMEMIYAA，ISHIIM，etal.Orexinsandorexinreceptors:afamilyofhypothalamicneuropeptidesandGprotein-coupledreceptorsthatregulatefeedingbehavior[J].Cell，1998，92(4):573.

[5]CUTLERDJ，MORRISR，SHENRIDHARV，etal.Differentialdistributionoforexin-Aandorexin-Bimmunoreactivityintheratbrainandspinalcord[J].Peptides，1999，20(12):1455.

[6]李庆梅，雷治海，陈敏，等.猪下丘脑开胃素A的分布定位[J].南京农业大学学报，2005，28(2):99.

[7]NAKABAYASHIM，SUZUKIT，TAKAHASHIK，etal.Orexin-Aexpressioninhumanperipheraltissues[J].Mol Cell Endocrinol，2003，205(1):43.

[8]KICHGESSNERAL.Orexinsinthebrain-gutaxis[J].Endocr Rev，2002，23(1):1.

[9]俞诗源，刘小媛，吴转子，等.中药复方液对麻黄素损伤小鼠卵巢的保护作用[J].西北师范大学学报(自然科学版)，2014，50(3):79.

[10]GALASL，VAUDRYH，BRAUNB，etal.Immunohistochemicallocalizationandbiochemicalcharacterizationofhypocretin/orexin-relatedpeptidesinthecentralnervoussystemofthefrogRana ridibunda[J].J Comp Neurol，2001，429(2):242.

[11]OHKUBOT，BOSWELLT，LUMINEAUS.Molecularcloningofchickenprepro-orexincDNAandpreferentialexpressioninthechickenhypothalamus[J].Bba-gene Struct Expr，2002，1577(3):476.

[12]HORVATHTL，DIANOS，VANDP.Synapticinteractionbetweenhypocretin(orexin)andneuropeptideYcellsintherodentandprimatehypothalamus:anovelcircuitimplicatedinmetabolicandendocrineregulations[J].J Neuroscl，1999，19(3):1072.

[13]FABRISC，COZZIB，HAYSCHMIDTA，etal.Demonstrationofanorexinergiccentralinnervationofthepinealglandofthepig[J].J Comp Neurol，2004，471(2):113.

[14]MARIAJ，SANEHEZ.Orexinsinthebrain-gutaxismariamaria[J].Endocr Rev，2002，23(1):1.

[15]陈敏.兔体内Orexin的分布定位[D].南京：南京农业大学， 2005.

[16]DYERCJ，TOUCHETTEKJ，CARROLLJA，etal.Cloningofporcineprepro-orexincDNAandeffectsofanintramuscularinjectionofsyntheticporcineorexin-Bonfeedintakeinyoungpigs[J].Domest Anim Endocrin，1999，16(3):145.

[17]JASZBERENYIM，BUJDOSOE，PATAKII，etal.Effectsoforexinsonthehypothalamic-pituitary-adrenalsystem[J].J Neuroendocrinol，2000，12(12):1174.

[18]KROWICKIZK，BURMEISTERMA，BERTHOUDHR，etal.Orexinsinratdorsalmotornucleusofthevaguspotentlystimulategastricmotorfunction[J].AM J Physiol-gastr L，2002，283(2):465.

[19]SHIRASAKAT，TAKASAKIM，KANNANH.Cardiovasculareffectsofleptinandorexins[J].AM J Physiol-reg I，2003，284(3):639.

[20]王进宝，王建林，邵宝平.食欲素调控机体糖代谢[J].动物营养学报，2013，25(11):2520.

(责任编辑俞诗源)

Differential expression of Orexin Aingastrointestinaltractbetweenyakandcattle

DINGYan-ping1,MENGYuan1,ZHANGJin-ping1,SHAOBao-ping2

(1.SchoolofLifeScience,NorthwestNormalUniversity,Lanzhou730070,Gansu,China;2.CollegeofLifeSciences,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,Gansu,China)

ToexploretheregulationeffectofOrexinAonenergymetabolismofyakbyanalyzingthedifferenceofdistributionandexpressioningastrointestinaltractbetweenyakandcattle.ImmunohistochemistryisusedtolocalizetheexpressionofOrexinAinthegastrointestinaltractoftheyak,Image-ProPlus6.0softwareisusedtosemi-quantitativeanalysetheintensityofexpressionofOrexinA.ResultsshowthatOrexinAiswidelyexpressedintheabomasum,pylorusandduodenumcardiainyakandcattle,whichhavedifferentexpressionalcharacteristics;ThemeanabsorbanceofOrexinApositivereactionproductinstomachtissueandduodenumofyakissignificantlylowerthanthatofcattle(P<0.01);BycomparingthemeanabsorbanceofOrexinApositivereactionproductintheyak,itisfoundthatitsexpressionfromstrongtoweaksuccessivelyisabomasumsarea,pyloricregion,cardiacregion,andthenduodenumarea(P<0.01).ItindicatsthatthelowerexpressionofOrexinAcouldregulatethehormonelevelsinthecentralandperipheraltissuestomaintainitsenergybalancetoadapttotheextremeenvironmentoftheTibetanplateau.

OrexinA；gastrointestinaltract；yak；cattle

10.16783/j.cnki.nwnuz.2016.03.019

2016-01-15;修改稿收到日期:2016-04-01

国家自然科学基金资助项目(31060141,31000190)

丁艳平(1980—)，女，副教授，博士，硕士研究生导师.主要研究方向为发育神经生物学.

E-mail:dingyp05@163.com

Q946

A

1001-988Ⅹ(2016)03-0101-05