李松，刘欣，刘红坚，刘俊仙，余坤兴，卢曼曼，淡明，刘丽敏，何毅波，张伟珍

（广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所/广西蔗糖产业协同创新中心，南宁530007）

次氯酸钠在甘蔗开放式组培苗繁殖中的应用研究

李松，刘欣，刘红坚，刘俊仙，余坤兴，卢曼曼，淡明，刘丽敏，何毅波，张伟珍

（广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所/广西蔗糖产业协同创新中心，南宁530007）

以常规组培方式获得的新台糖22号无菌继代苗为材料，将不同浓度的次氯酸钠溶液加入到培养基中，研究次氯酸钠在甘蔗开放式组织培养的有效浓度，以及增殖培养、生根培养的最佳浓度。结果表明，次氯酸钠浓度在800mg/L以上可有效抑制培养基的污染，组培苗的增殖系数以900～1000mg/ L较好，生根效果以1000～1100mg/L为佳。结论：在甘蔗开放式培养中，次氯酸钠的浓度以1000mg/L为宜。

甘蔗；次氯酸钠；开放式组织培养

甘蔗是我国重要的糖料作物，其种植面积、产糖量均占全国总量的90%左右。甘蔗属无性繁殖作物，生长时间长、用种量大，其繁殖速度慢，大大抑制新良种的推广应用速度。植物组织培养具有节省大量的空间及时间，培养过程不受外在环境因子的影响，且终年均可进行等优点，常被广泛推广与应用于无病毒苗大量繁殖、诱变育种、转基因、次生代谢物生产、人工种子等领域，并产生巨大效益。近30年来在甘蔗新品种推广过程中，应用植物组织培养技术推广一大批甘蔗新良种，并产生较大的经济效益。但组培技术对无菌环境有严格要求，例如无菌操作台、生物安全柜或高压灭菌锅等配套措施，都是围绕防止污染而制定的。而影响污染的因素多种多样，如外植体的种类，取材的季节、时间，顶处理方法，消毒药剂的种类、浓度，消毒时间以及消毒方法；培养基和器皿灭菌，操作人员、工作环境的要求，超净工作台的工作质量等都与污染紧密相关。因此，污染问题成为限制组培产业化的重要原因之一，也使组培技术应用范围受到极大的限制，不利于在常规农业生产中推广与普及。因此，简化组织培养技术、防止污染成了组培研究中不可或缺的主要工作。

传统组织培养技术要求严格的无菌条件，需大量的设施设备及繁杂的操作程序，生产成本高[1]，使该技术的推广受到较大的限制。植物开放式组织培养，是在杀菌剂的作用下，使植物组织培养脱离严格无菌的操作环境，不需高压灭菌和超净工作台，利用塑料杯代替组培瓶，在自然、开放的有菌环境中进行植物的组织培养，从根本上简化组培环节，降低组培成本[2]。日本等国开放组培已广泛应用于菊花及兰花等观赏植物的组织培养中[3]，我国科研工作者在植物开放式组织培养中进行了大量研究[4]，并在荸荠[5]、白菜[6]、香蕉[7-8]、魔芋[9－10]、红豆杉[11]、梅花[12]、马铃薯[13]、烟草[14]等植物研究中建立了开放式组织培养技术体系，但甘蔗中未见有相关报道。本研究通过在甘蔗组织培养增殖、生根阶段培养基中添加不同浓度的次氯酸钠溶液，以期建立甘蔗的开放组培体系，简化组培步骤，降低工厂化生产成本。

1 材料与方法

1.1 材料

供试甘蔗材料为新台糖22号茎尖增殖苗；次氯酸钠为通过供应商购买，有效浓度为10%。

1.2 方法

1.2.1 培养基的准备开放式组培增殖与生根培养基选用传统甘蔗组培苗生产中普遍使用的MS培养基配方[15]，培养基为液体，开放组培的培养基pH值调至5.8时加入一定浓度次氯酸钠溶液，不经过高温高压灭菌，充分搅拌培养基，定量分装入洁净的玻璃瓶中封口备用。对照组培养基按常规方法进行高压灭菌。

1.2.2 开放式培养接种选择相对独立的普通实验室作为接种室，使用前用浓度70%的酒精喷洒接种室自然落菌，再用紫外灯照射0.5h。接种过程与传统组培接种方法相同。

1.2.3 添加不同浓度次氯酸钠培养基的污染率试验以MS培养基为基本培养基，分别加入次氯酸钠，A1：0、A2：10、A3：50、A4：100、A5：200、A6：400、A7：600、A8：800、A9：1000、A10：1200、A11：1400、A12：1600、A13：1800 mg/L，以常规高压消毒培养基不添加次氯酸钠为对照ACK。培养基为液体培养基，每个处理40瓶，3次重复，分装后盖好瓶盖放在培养室观察；20d后观察并记录污染瓶数，统计污染率；随后在上述未污染培养基中接入常规无菌增殖组培苗，20d后观察并记录污染瓶数，统计污染率。

污染率＝污染瓶数/接种总瓶数×100%。

1.2.4 增殖培养次氯酸钠浓度的筛选在空白试验基础上，采用增殖培养基MS+6BA 1.5mg/L+NAA 0.1mg/ L+蔗糖30g/L，添加次氯酸钠溶液进行次氯酸钠浓度的筛选，其浓度梯度设置为B1：800、B2：850、B3：900、B4：950、B5：1000、B6：1050、B7：1100、B8：1150、B9：1200mg/L，接种时采用开放式方法。以经过高温高压灭菌的培养基为对照BCK，超净工作台接种。每个处理培养40瓶，每瓶接种2丛、每丛5株左右的增殖苗，3次重复。20d后观察并记录增殖的苗数，统计增殖系数和增殖率。选取蔗苗增殖系数高的次氯酸钠浓度为甘蔗开放组培增殖培养的最佳浓度。

增殖系数=试验后每瓶苗数/试验前每瓶苗数（不含污染瓶苗数）；增殖率=试验后总苗数/试验前总苗数（含污染瓶苗数）×100%。

1.2.5 生根培养次氯酸钠浓度的筛选生根培养开放式试验采用生根培养基MS+NAA 5.0mg/L+蔗糖30g/ L，次氯酸钠浓度梯度设置为C1：800、C2：850、C3：900、C4：950、C5：1000、C6：1050、C7：1100、C8：1150、C9：1200mg/L，对照处理及接种方式与增殖培养次氯酸钠浓度的筛选相同。从增殖培养无菌苗中选取长势、数量等基本一致的瓶苗1200瓶，然后每个处理随机选取40瓶进行试验，3次重复。20d后观察并记录每瓶苗生根情况，并进行假植，约30d后分单株统计假植成活苗数，并计算平均每瓶所得苗数（不含污染瓶）。选取蔗苗生根率高且移栽成活率高的次氯酸钠浓度为甘蔗开放组培生根培养的最佳浓度。

生根率=生根苗瓶数/接种总瓶数（不含污染瓶数）×100%。

1.3 试验数据分析

试验数据收集整理采用Excel表，方差分析采用DPS数据处理系统Duncan新复极差法进行。

2 结果与分析

2.1 不同浓度的次氯酸钠对培养基污染率的影响

不同处理浓度的次氯酸钠对培养基污染率的影响见表1。由表1可见，在空白试验中，培养基污染率随着次氯酸钠浓度的升高而降低，10mg/L浓度时培养基的污染率为85.83%，100mg/L浓度培养基污染率为15.00%，浓度在200mg/L以上时培养基的污染率为0；对上述未污染培养基接种常规无菌瓶苗再试验，结果污染率也随着次氯酸钠浓度的升高而降低，其中10～100mg/L培养基污染率为100%，在200～600mg/L之间的污染率与传统组培方式差异极显著，在800～1000mg/L之间时培养基的污染率与传统高温高压灭菌方式差异不显著，次氯酸钠浓度在1200mg/L以上对污染已可完全抑制，污染率为0。因此，次氯酸钠可以作为甘蔗开放式培养的抑菌剂，以浓度在800～1200mg/L之间为宜。

2.2 增殖培养最佳次氯酸钠浓度

在增殖培养基中添加不同浓度次氯酸钠对甘蔗组培苗繁殖影响结果见表2。从表2可见，培养基污染率随着次氯酸钠浓度的升高而降低，其中，最高为B1达15.83%，最低为B8和BCK污染率均为4.17%，经方差分析，BCK与B8、B9间差异不显著，与其他处理达极显著水平。在组培苗增殖方面，若考虑污染因素，即最终每瓶组培苗数以不污染瓶数进行平均，其增殖系数随着次氯酸钠浓度的升高而降低，其中增殖系数最大为对照，达2．34，其次为B1，为2．15，经方差分析，差异达显著水平；若不考虑污染因素，即以试验初始苗数与最终组培苗数进行计算组培苗增殖率，结果增殖率出现先升后降的情况，其中，增殖率最高为BCK124．43%，其次为B3，为90．32%，增殖率从大到小依次为：BCK＞B3＞B5＞B4＞B2＞B1＞B7＞B6＞B8＞B9，经方差分析，BCK与各处理均达极显著水平，B3、B4、B5间差异不显著。综合污染率与成活率，增殖培养中次氯酸钠处理浓度以900～1000mg/L为宜。

表1 添加不同浓度次氯酸钠培养基污染情况

表2 培养基中添加不同浓度的次氯酸钠蔗苗增殖情况

2.3 生根培养最佳次氯酸钠浓度

在生根培养基中添加不同浓度次氯酸钠对甘蔗组培苗生根影响结果见表3。从表3可见，培养基污染率随着次氯酸钠浓度的升高而降低，污染率最高为C1，达16．7%，最低为C9和CCK，均为4．2%，经方差分析，CCK除与C8、C9差异不显著外，与其他处理均达极显著水平。在生根率方面，以瓶为单位统计，除去污染瓶外，其生根率为100%，从外观看，加有次氯酸钠的苗长势略差于对照，主要表现在根的量相对少些、蔗苗不够清秀等；处理生根苗假植成活率较高，均在93%以上，但各处理假植成活率高低与次氯酸钠浓度的大小没有规律性，其中最高为C3，达96．5%，最低C4，为93．2%；假植成活苗数随着次氯酸钠浓度的提高出现先升后降的情况，成活苗数最多为CCK，达4678株，最少为C1，为3354株，CCK与各处理间均达到极显著水平，C1与C6差异达显著水平，其他处理间差异不显著。若把污染瓶去除后平均每瓶所得成活苗数，每瓶所得成活苗基本上随次氯酸钠浓度的增加而减少，但规律性不很明显。其中CCK得苗最多，平均每瓶所得成活苗数为40．7株，其次是C6，为35．9株，最少为C9，只有30．5株。经方差分析，CCK与C6差异达显著水平，与其他处理间差异达极显著水平；C6与C8、C9处理间差异达显著水平，其他处理间差异不显著。综合污染率与成活率，生根培养中次氯酸钠浓度以1000～1100mg/L为宜。

表3 培养基中添加不同浓度的次氯酸钠蔗苗生根情况

3 讨论

目前在植物开放式组培研究中，利用抗生、农药、家用消毒剂、植物提取物、食品添加剂等作为抑菌剂方面的研究均有报道。次氯酸钠消毒剂是一种含有效氯和表面活性剂，能渗透各种有机物，对细菌、芽孢、病毒、结核杆菌增多有较强的杀灭作用，是一种高效消毒剂，在植物开放式组培中见有报道。王晓煌等[14]在烟草开放式组织培养研究中发现，低浓度的次氯酸钠对烟草外植体诱导分化无明显抑制作用，且能促进烟草外植体叶的分化；高浓度抑菌完全但外植体坏死率高，0．05%～0．01%次氯酸钠抑菌效果良好，外植体成活率100%。解辉等[8]在巴西香蕉开放式组培研究中发现，次氯酸钠作为香蕉开放式培养的抑菌剂，以浓度在0．01%～0．02%之间最好，增殖与生根培养选择0．014%浓度最佳，在此浓度下香蕉增殖系数与生根率较高，分别为2．48%、83．0%。

本试验结果，培养基中次氯酸钠含量在800～1000mg/L之间时，培养基的污染率与传统高温高压灭菌方式的污染率差异不显著，次氯酸钠浓度在1200mg/L以上对污染已可完全抑制，污染率为0；因此，次氯酸钠可以作为甘蔗开放式培养的抑菌剂，以浓度在800～1200mg/L之间为宜。本试验加入次氯酸钠后，对甘蔗组培苗的增殖速度及生根均产生不同程度的影响，而且其影响程度随次氯酸钠浓度的提高而加重。虽然低浓度次氯酸钠对组培苗生长影响程度相对较低，但其污染率较高，损失蔗苗较多，最后获得的有效苗数不是最多；高浓度次氯酸钠可有效抑制污染，但对组培苗生长影响程度较大，最后获得的有效苗数也不是最多。在增殖培养方面，次氯酸钠浓度900mg/L处理的增殖率最多，为90．32%，但低于对照的124．43%，其次是1000mg/L处理和950mg/L处理，增殖率也达88%以上；在生根培养方面，除去污染瓶外，各处理生根率均为100%，但从外观看，加有次氯酸钠的蔗苗根的量相对少些、蔗苗不够清秀，最后生根苗假植获得成活苗数最多的是1050mg/L，达3959株，其次是浓度1100mg/L处理，为3801株，均低于对照的4678株。因此，在一定浓度条件下，次氯酸钠不仅可以抑制甘蔗组培过程中菌类的繁殖，而且对甘蔗组培苗繁育抑制作用不明显，最宜浓度为900～1100mg/L。

抑菌剂加入培养基后，对菌类的繁衍有较好的抑制作用，但甘蔗组培苗的生长也受到一定程度的抑制和伤害，这与前人在其他植物的研究相似[8，16]。至于抑制和伤害等机理，有待进一步的研究。开放式组织培养技术由于对环境无严格的无菌要求，操作程序简化，成本降低，是未来植物组织培养发展的主要方向。

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Application Research of Sodium Hypochlorite in Open Tissue Culture of Sugarcane Rapid Propagation

LI Song,LIU Xin,LIU Hong-jiang,LIU Jun-xian,YU Kun-xing,LU Man-man,DAN Ming,LIU Li-min, HE Yi-bo,ZHANG Wei-zhen
(Sugarcane Research Institute,GXAAS/Collaborative Innovation Center of Sugarcane Industry,Nanning,Guangxi 530007)

Sugarcane ROC22 shoots,which was obtained from normal tissue culture,was used as subculture material to determine the effective concentration of sodium hypochlorite in open tissue culture and the optimal concentration at multiplication culture and rooting culture.The results showed that the concentration of sodium hypochlorite was effective for inhibition of medium pollution at more than 800 mg/L,better for proliferation rate at 900~1000 mg/L,and best for rooting at 1000~1100 mg/L.Conclusion:in sugarcane open culture,1000 mg/L hypochlorite was advisable.

sugarcane;sodium hypochlorite;open tissue culture

S566.1；Q81

A

1007－2624（2016）06－0003－04

10.13570/j.cnki.scc.2016.06.002

2016-07-18

广西自然科学基金项目“甘蔗开放式组织培养技术研究”（2014GXNSFAA118090）、广西农业科学院科技发展基金项目“甘蔗组织培养抑菌剂筛选研究”（2015JZ06）。

李松（1964-），男，广西博白人，研究员，硕士，研究方向：甘蔗生物技术、诱变育种与栽培。E-mail：ls19009@163.com