杨　婷　莫　亚　陈莉苹　黄秀蓉　曹　斌

补虚化瘀法对豚鼠形觉剥夺性近视模型多焦视网膜电图的影响

杨婷莫亚陈莉苹黄秀蓉曹斌

目的 通过观察补虚化瘀法对豚鼠形觉剥夺性近视(form deprivation myopia,FDM)多焦视网膜电图(multifocal electroretinogram,mf ERG)的影响,探讨具有补虚化瘀功效的中药制剂八珍颗粒是否对形觉剥夺性近视豚鼠视网膜功能有影响.方法 将16只3周龄豚鼠随机分为两组:模型组、补虚化瘀组,每组各8只,右眼为剥夺眼,采用半透明眼罩遮盖诱导形觉剥夺性近视,左眼不予处理,为对照眼.补虚化瘀组予八珍颗粒混悬液1.12 g/(kg.d),每天同一时间灌胃1次,模型组予蒸馏水1 mL灌胃1次.所有动物在造模前与造模4周后进行带状检影,造模后进行多焦视网膜电图检查.结果 (1)经过4周形觉剥夺,豚鼠右眼向近视转变,与造模前比较,豚鼠右眼近视屈光度有显著改变(P<0.05),而模型组右眼屈光度与补虚化瘀组右眼屈光度比较无明显差异(P>0.05). (2)形觉剥夺4周后,模型组右眼1、2环N1波峰时,1、2环P1峰时较模型组左眼延迟,差异有统计学意义(P<0.05);模型组右眼总波、1、2、3环N1波反应密度,总波、1、2、3、4环P1波反应密度较模型组左眼显著降低,差异有统计学意义(P<0.05);补虚化瘀组右眼1环N1波峰时,总波、2环P1波峰时较模型组右眼延迟,差异有统计学意义(P<0.05).中药制剂八珍汤颗粒组右眼总波、2、3环N1波反应密度,总波、1、2、3、4环P1波反应密度均较模型组右眼有所增加,差异有统计学意义(P<0.05).结论 补虚化瘀法有助于形觉剥夺性近视豚鼠视网膜mf ERG反应密度、峰时及其功能的恢复.

补虚化瘀; 豚鼠形觉剥夺近视模型; 多焦视网膜电图

近年来,大量的研究表明,近视是全球最常见的视力损害的原因[1],也是发生率最高的屈光不正,目前儿童和青少年近视发病年龄提前,发病率明显增高[2].其中19.5%在后期发展为高度近视[3],后者往往因后巩膜葡萄肿、视网膜脉络膜萎缩、Fuchs斑、漆裂纹及脉络膜新生血管(choroidal neovascularization,CNV)[4]等严重并发症出现而导致视力下降,因此对于近视应早期干预,早期进行视功能保护.现代药理学研究证实,许多中药具有改善微循环、抗血栓、降低血液黏滞度、提高机体抗氧化能力、清除自由基、减轻缺血再灌注损伤等多方面的药理作用.因此,从中医药中发掘近视视功能保护的药物将越来越受到医学界的重视.笔者采用半透明眼罩遮盖诱导形觉剥夺性近视动物模型,选取中药制剂八珍颗粒作为干预药物,通过屈光度、多焦视网膜电图(multifocal electroretiongram, mf ERG)等客观指标的变化,探讨补虚化瘀法对近视视功能的保护作用.

1　材料和方法

1.1实验动物

3周龄三色豚鼠16只,体质量180～220 g,雌雄不限(英国种,许可证号:SCXKI川72008-14,四川省实验动物专委会养殖场提供).所有动物均在装有清洁过滤器的笼子中饲养,于室内标准化喂养,温度保持在22～25℃,相对湿度50%,饲料与水均自由摄取,每天补充新鲜蔬菜.纳入标准:无外眼疾病;双眼瞳孔对光反射正常;无歪颈.

1.2主要实验材料、试剂及仪器

蒸馏水(成都中医药大学附属医院);中药制剂八珍颗粒(宁波立华制药有限公司);复方托吡卡胺滴眼液(参天制药株式会社,中国);0.5%盐酸丙美卡因滴眼液(S.A.ALCON-COUVREUR N.V.);带状光检影镜(中国苏州六六公司,YZ24型);6号乳白色气球(上海维曼乳胶制品有限公司);Reti Scan 3.15多焦电生理系统(德国Roland公司).

1.3动物分组

实验动物购回后,适应性喂养3天后进入实验程序,采用随机法将豚鼠分为两组,依次为模型组、补虚化瘀组,每组8只,根据豚鼠颜色进行描述标记.

1.4动物模型制备及给药

将所有豚鼠右眼作为剥夺眼,用6号乳白色气球(上海维曼乳胶制品有限公司)套住豚鼠头部,剪去左眼、鼻唇部及双耳部橡皮,使之暴露,右眼保留遮盖[5].补虚化瘀组用中药八珍颗粒混悬液灌胃1.12 g/(kg.d),并将右眼剥夺眼标记为补虚化瘀组右眼,左眼未剥夺标记为补虚化瘀组左眼;模型组用蒸馏水1 mL灌胃,并将模型组右眼剥夺眼标记为模型组右眼,左眼未剥夺眼标记为模型组左眼.每天定时巡视4次,确保气球遮盖豚鼠右眼,喂养4周.每周称体重1次,调整给药量.

1.5屈光度测定

使用睫状肌麻痹剂复方托吡卡胺滴眼液滴豚鼠双眼,每5分钟滴1次,共4次,1小时后进行带状光检影验光,由验光经验丰富的检查者在未知分组情况下检影(散光以半量计为等效球镜).分别于造模前及造模后各检影一次.

1.6mf ERG检测

所有豚鼠右眼予托吡卡胺滴眼液充分散瞳至2～3 mm,暗适应30分钟,用动物固定架将豚鼠四肢分别固定,豚鼠被放置于显示器前约20 cm的固定架上.同时予0.5%盐酸丙美卡因滴眼液角结膜表面麻醉,刺激方法参照Ball及Nusinowitz法[6-7],刺激采用图形同心圆排列的61个六角形,用21寸显示器显示.61个六角形由计算机产生二进制m-序列的假随机序列交替出现亮帧和暗帧,单位格的局部ERG反应由计算机自动处理记录.刺激采用1:4亮暗对比,即1个亮帧之后有4个暗帧,暗帧之后每个六角形按m-序列随机出现亮暗帧,反复进行,47秒一个时段,每次测试共记录4个时段.通频带5～100 Hz.电极均为不锈钢针,R+极直接插入眼角膜边缘,R-极插入前额皮下,地电极插入臀部.经放大器放大(X10,000)并滤过(1 Hz/1 kHz).以Reti Scan系统中程序对mf ERG的波形进行自动分析,分析总波形、5个环的N1波和P1波的峰潜伏(ms)、振幅(μV)并计算反应密度(nV/deg2).

1.7统计学处理

所有数据输入计算机,采用SPSS 13.0软件进行统计分析,计量资料以均数±标准差表示.各组间指标比较采用单因素方差分析(one-way AVOVA),屈光度、各组间mf ERG的N1波、P1波的总波、5环的峰时、反应密度方差齐性,两组之间采用LSD比较,P<0.05为差异具有统计学意义.

2　结果

2.1各组豚鼠屈光度比较

造模前,各组间比较采用单因素方差分析, F=0.370,P>0.05,说明各组间豚鼠屈光度数相当;造模后,豚鼠各组屈光度比较经单因素方差分析,F=11.27,P<0.05,说明各组间豚鼠屈光度不全相同,两两比较采用LSD法,与模型组左眼比较,模型组右眼与补虚化瘀组右眼近视屈光度增大(P<0.05),说明采用气球遮盖造豚鼠形觉剥夺近视模型成功;补虚化瘀组右眼与模型组右眼比较,屈光度无显著差异(P>0.05),说明补虚化瘀法对豚鼠形觉剥夺近视屈光度的进展无明显的抑制作用.具体见表1.

表1　补虚化瘀法对豚鼠形觉剥夺性近视屈光度的影响（±s)

表1　补虚化瘀法对豚鼠形觉剥夺性近视屈光度的影响（±s)

注:与模型组左眼比较,aP<0.05;与模型组右眼造模前比较,bP<0.05;与补虚化瘀组右眼造模前比较,cP<0.05.

组别造模前屈光度(D)一月后屈光度(D) 0.00±3.10-0.46±1.73模型组右眼0.82±2.44-4.67±2.79ab补虚化瘀组右眼1.67±0.47-3.02±1.48模型组左眼ac

2.2各组豚鼠mf ERG结果比较

N1波峰时显示:与模型组左眼比较,模型组右眼在1、2环的峰时明显延迟(P<0.05),补虚化瘀组右眼在2环的峰时明显延迟(P<0.05),说明对豚鼠形觉剥夺后,可引起mf ERG的N1波峰时的延长;模型组右眼与补虚化瘀组右眼比较,除补虚化瘀组右眼在1环的峰时明显变短外(P<0.05),其余总波、2、3、4、5环峰时无显著差异(P>0.05),说明补虚化瘀中药制剂八珍颗粒对豚鼠形觉剥夺后mf ERG的N1波峰时除1环有一定恢复外,其余各环及总波均无明显影响.见表2.

N1波反应密度显示:与模型组左眼比较,模型组右眼在总波、1、2、3、4、5环的反应密度变化有显著差异(P<0.05),说明豚鼠形觉剥夺后,可引起N1波除5环外的各波及总波的反应密度下降,而补虚化瘀组右眼与模型组左眼比较,除1环有显著差异(P<0.05)外,其余总波、2、3、4、5环反应密度无显著差异(P=0.616,0.083,0.464,0.784, 0.335>0.05),说明补虚化瘀组右眼与模型左眼N1波除1环外的反应密度相当.与模型组右眼比较,补虚化瘀组右眼在总波、2、3环反应密度增高(P<0.05),说明补虚化瘀中药制剂八珍颗粒有助于豚鼠形觉剥夺后N1波中总波及2、3环反应密度的恢复.见表2.

P1波峰时显示:模型组右眼与模型组左眼比较,模型组右眼P1波峰时在总波、1、2环有显著差异(P<0.05),说明对豚鼠形觉剥夺后,可引起mf ERG的P1波峰时在总波、1、2环的延迟;模型组右眼与补虚化瘀组右眼比较,除补虚化瘀组右眼在总波、2环的峰时明显变短外(P<0.05),其余1、3、4、5环峰时无显著差异(P>0.05),说明补虚化瘀中药制剂八珍颗粒对豚鼠形觉剥夺后mf ERG的P1波峰时除总波及1环有一定恢复外,其余各环均无明显影响.见表2.

表2　补虚化瘀法对豚鼠形觉剥夺性近视mf ERG的影响(±s)

表2　补虚化瘀法对豚鼠形觉剥夺性近视mf ERG的影响(±s)

注:与模型组左眼比较,aP<0.05;与模型组右眼比较,bP<0.05.

组别N1波峰时(ms)反应密度(nV/deg2) P1波峰时(ms)反应密度(nV/deg2) 19.80±6.444.46±2.6046.17±2.278.32±2.47总波模型组左眼18.53±7.066.89±1.5441.34±6.1713.88±3.95模型组右眼22.19±6.382.37±2.01a67.17±6.54a7.07±4.09a补虚化瘀组右眼19.47±6.745.61±2.13b45.91±3.27b10.83±2.59ab1波模型组左眼10.96±5.4647.95±30.3928.94±9.1781.75±6.88模型组右眼29.30±7.83a29.16±22.71a41.91±8.91a54.49±5.45a补虚化瘀组右眼12.81±.6.40b29.31±33.93a36.88±2.3476.02±4.49b2环模型组左眼13.93±6.6812.08±3.7228.54±6.1722.96±11.10模型组右眼25.58±3.09a6.06±4.12a42.68±9.52a12.00±5.11a补虚化瘀组右眼22.24±5.79a11.25±3.42b29.69±2.57b20.27±5.23b3环模型组左眼18.49±13.358.14±2.7848.53±2.7314.23±4.00模型组右眼23.25±7.384.75±1.63a43.51±4.566.24±4.02a补虚化瘀组右眼20.89±7.377.27±2.48b46.81±4.2011.97±3.23b4环模型组左眼17.91±6.446.47±3.3145.43±4.1011.66±5.07模型组右眼19.16±7.043.46±1.91a41.99±5.427.73±4.61a补虚化瘀组右眼18.24±7.054.21±2.5745.72±4.9410.52±5.65b5环模型组左眼18.87±5.045.58±1.0347.15±3.259.21±4.86模型组右眼22.40±3.564.78±1.9243.94±6.686.57±3.72补虚化瘀组右眼

P1波反应密度显示:与模型组左眼比较,模型组右眼在总波、1、2、3、4环的反应密度变化有显著差异(P<0.05),说明豚鼠形觉剥夺后,可引起P1波除5环外的各波反应密度下降,而补虚化瘀组右眼与模型组左眼比较,总波反应密度有明显下降(P<0.05)外,其余1环、2、3、4、5环反应密度无显著差异(P>0.05),说明补虚化瘀组右眼与模型左眼P1波除总波外的反应密度相当;与模型组右眼比较,补虚化瘀组右眼在总波、1、2、3、4环反应密度增高(P<0.05),说明补虚化瘀中药制剂八珍颗粒有助于豚鼠形觉剥夺后P1波中总波及1、2、3、4环反应密度的恢复.见表2.

3　讨论

近视发病率高,中国学生近视发生率位居世界第二位,呈低龄化和上升趋势[8-9].近视可发展成为高度近视,严重影响视功能,出现巩膜变薄、视网膜和脉络膜萎缩,成为常见的致盲眼病之一[10-12].研究发现9～13岁儿童在近视发展过程中已经出现中心及旁中心内层视网膜功能下降[13],年龄在18～25岁之间的高度近视患者也在没有出现近视性视网膜病变且中心视网膜厚度在正常范围的情况下发现有视功能下降[14].莫亚等[15]的研究发现,随着年龄的增加,视野平均光敏感度降低,视功能下降.因此,积极探索早期近视视功能保护的方法尤为重要.

豚鼠为常用的近视动物模型[16-19].豚鼠出生后即开眼,一般在3周后给予诱导,诱导8周左右可获得-8.00 D左右的近视.作为哺乳动物,眼球结构基本和人类相似,巩膜组织在近视发生发展过程中细胞外基质降解,正视化机制和人类比较相似[20].本实验选用3周龄三色豚鼠套头罩造成形觉剥夺近视模型,造模前后,各组屈光度比较差异明显,P<0.05(见表1),造模成功.

mf ERG可以在数分钟内同时记录视网膜不同部位的电反应,分别提取波形,反映视网膜不同层次细胞功能变化,有助于了解视网膜或视路病变的机制,可用于一些眼病的早期诊断及预后判断. mf ERG波形是一个反应开始后的负向波紧随着一个正向的双极波,其后再一个负向波,分别为N1、P1、N2.N1反应和全视野锥细胞的a波有相同的细胞构成,P1含有全视野锥细胞的b波振荡电位的成分[21].罗俊[22]研究推测:N1起源于视锥细胞的电活动,P1、N2起源于双极细胞的电活动,代表视网膜内核层的电活动.而Mao X等[23]研究认为mf ERG可以敏感地反映视网膜神经节细胞的功能.Han等[24]研究认为近视度数值对后极部视网膜功能呈负相关影响mf ERG平均反应密度与视网膜视锥细胞的分布相一致,即在黄斑区密度增高,随着离心度的增高而减少,一阶反应主要代表视网膜外层细胞的功能,主要反映视锥细胞的功能状态.

中医对近视早有认识,隋代医家巢元方《诸病源候论》已有"目不能远视"的记载,《审视瑶函》称高度近视为"禀受生存近觑之病"《素问.宣明五气篇》曰"久视伤血",认为高度近视与生俱来,或因长期过用目力,久视耗血伤精所致.血为气之母,血虚气亦虚,因此本研究选用具有补气养血的中药方剂八珍汤颗粒进行视功能调控.

八珍汤由四君子汤和四物汤组合而成,具有补益气血的功效,主治气血两虚证,为临床常用方剂.现代药理研究认为八珍汤能改变血"黏" "浓""凝""聚"状态,表明其具有一定的活血化瘀作用,这可能与八珍汤中的当归、川芎、白芍、白术等药味的活血化瘀功效或抗血凝作用有关[25].八珍汤主要药理作用包括改善造血功能、改善血液流变性、提高机体免疫能力、抗氧化抗衰老等[26].其中人参还能够针对神经细胞提供系统且有效的保护[27],人参提取物人参皂苷Rg1抗氧自由基修复视网膜色素上皮(retinal pigment epithelium,RPE)细胞损伤的机制是通过清除氧自由基、减少此RPE细胞脂质过氧化的发生,从而有效地抑制细胞调亡,有利于RPE细胞的生存[28-29].

本实验发现补虚化瘀中药制剂八珍颗粒在短时间内对豚鼠形觉剥夺性近视屈光度进展无明显抑制作用,对于八珍颗粒在长时间内对豚鼠形觉剥夺性近视屈光度进展有无抑制作用尚待进一步研究.此外,豚鼠形觉剥夺后N1波、P1波峰时有部分延迟,反应密度有一定程度的降低,这与GAO等[30]的研究结果相似;而补虚化瘀中药制剂八珍颗粒有助于N1波、P1波峰时、反应密度的部分恢复,推测补虚化瘀法可能对豚鼠形觉剥夺性近视模型的视功能有部分改善作用.由此,推测本实验中八珍颗粒对豚鼠形觉剥夺近视的视网膜功能可能有一定的保护作用,提示补虚化瘀法可以部分改善豚鼠形觉剥夺性近视的mf ERG.

综合本研究结果,推测补虚化瘀法可能对豚鼠形觉剥夺性近视的视网膜感光细胞有一定的保护作用,补虚化瘀法可能通过清除氧自由基、抑制细胞凋亡、改善视网膜血管血液流变的途径,保护视网膜神经细胞,从而保护视功能.

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(本文编辑:禹佳)

Influences of traditional Chinese medicine of Buxu Huayu on the multifocal electroretinogram of a model of form deprivation myopia in guineas

YANG Ting,MO Ya,CHEN Li-ping,et al. Graduate School of Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Chengdu 610072,China Corresponding author:MO Ya,E-mail:myydcg@sohu.com

Objective To observe the effect of traditional Chinese medicine(TCM)of Buxu Huayu on the guinea of form deprivation myopia(FDM),and observe the effect of traditional Chinese medicine(TCM)of Bazhen granules on the retinal function of guinea of FDM.Methods 16 guineas were randomly divided into 2 groups:model control group(n=8)and Bazhen granules group(n=8),eight guineas each group.The right eyes of all guineas were form-deprived with semi-transparent membraes for 4weeks,and the left eyes were used as normal control without any treatment.Bazhen granules suspension1. 12 g/(kg.d)was given for consecutive 4 weeks in the guineas of Buxu Huayu group,and distilled water was given for consecutive 4 weeks in the guineas of model control group.Before and 4 weeks after form dep-rivation,refraction was measured by retinoscopy after cycloplegia.after given drugs or distilled water for 4 weeks,to observe the effection by multifocal electroretinogram(mf ERG).Results After 4 weeks of form deprivation,the guinea pigs's right eyes had myopic shift,and there was an approximately increase in FDM myopic refraction comparing to pre-models building;But the refraction was no obvious change between model control group and Bazhen decoction group after models builded in 4 weeks(P>0.05).The peak time of the N1 in the ring1-2 and the P1 in the total wave and ring1-2 in the model group's right eyes was statistically increased compared with that of the left eyes of the model group(P<0.05).The amplitude densities of the N1 in the total wave,ring1-3 and the P1 in the total wave,ring1-4 in right eyes of model group was statistically decreased compared with that of left eye in the model group(P<0.05).The peak time of the N1 in the ring1 and the P1 in the total wave and ring 2 in the right eyes of Buxu Huayu group was significantly decreased compared with that of right eye in the model group(P<0.05).The amplitude densities of the N1 in the total wave,ring2-3 and the P1 in the total wave,ring1-4 in the right eye of Buxu Huayu group was statistically improved compared with that of right eye in the model group(P<0.05). Conclusion Buxu Huayu can protect the visual function of guineas model of FDM by improving amplitude density and decreasing peak time of mf ERG.

Buxu Huayu; Form deprivation myopia; multfocal electroretiongram

R285.5

A

10.3969/j.issn.1674-1749.2016.01.004

四川省教育厅课题(11ZA065);四川省卫生厅课题(110527);成都中医药大学附属医院科技发展基金(2012-D-YY-12)

610072 成都中医药大学研究生院[杨婷(硕士研究生)、曹斌(硕士研究生)];成都中医药大学附属医院眼科(莫亚、黄秀蓉);天津医科大学总医院滨海医院眼科(陈莉苹)

杨婷(1988-),女,2013级在读硕士研究生.研究方向:中医药对视功能的保护.E-mail: 815396209@qq.com

莫亚(1971-),女,博士,硕士生导师,主任医师.研究方向:中医药对视功能的保护.E-mail: myydcg@sohu.com

2015-05-14)