董　坤，隋文霞，姚　琳，隋美娇，寇韩旭，马英丽

（1.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040；2.黑龙江省中医药科学院，哈尔滨150036）

桔梗抗MP有效部位对TGF-β1 mRNA表达的影响

董坤1，隋文霞1，姚琳2，隋美娇2，寇韩旭1，马英丽1

（1.黑龙江中医药大学药学院，哈尔滨150040；2.黑龙江省中医药科学院，哈尔滨150036）

探讨桔梗抗肺炎支原体（MP）有效部位对感染大鼠肺组织中TGF-β1 mRNA表达的影响.采用滴鼻法构建肺炎支原体肺炎大鼠模型，用光学显微镜观察大鼠肺组织形态学的变化，运用RTPCR法检测TGF-β1在空白对照组、模型对照组、阿奇霉素组、桔梗有效部位高、中、低剂量组的表达情况.结果表明，空白组大鼠的肺组织结构正常，模型组大鼠的肺组织呈重度或中度炎症病变，造模成功，给药各组大鼠的肺组织病变均有所改善.模型组大鼠肺组织中TGF-β1 mRNA的表达量明显增多，桔梗抗肺炎支原体有效部位高、中、低剂量组和阳性药组均能下调感染MP大鼠肺组织中TGF-β1的表达，其中阿奇霉素组和桔梗有效部位高剂量组效果最佳.桔梗有效部位对MP感染致大鼠肺损伤的修复作用机制可能是通过下调TGF-β1，抑制了上皮间质转化的过程.

桔梗；肺炎支原体；TGF-β1；实时荧光定量PCR

肺炎支原体肺炎（mycoplasma pneumoniae pneumonia，MPP）是由肺炎支原体（mycoplasma pneumonia，MP）感染引起的原发性非典型肺炎.目前，儿童MPP的发病率明显增加，发病年龄逐渐提前，MP已成为小儿呼吸道感染的重要病原之一.临床上多采用大环内酯类抗生素来治疗，该类抗生素不良反应大、副作用强，且国外已有支原体耐药菌株报道.桔梗是一种药食两用的临床常用中药，主要用于咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛喑哑、肺痈吐脓等症［1］.经课题组前期研究发现，桔梗75%乙醇提取物，经AB-8大孔吸附树脂柱，以不同浓度乙醇洗脱，其50%乙醇洗脱部位具有体外抗MP的作用，MIC值为25μg/mL［2］，定为桔梗抗MP的有效部位.转化生长因子-β1（Transforming growth factor-beta 1，TGF-β1）是一种多功能细胞因子，可调节细胞生长和分化，参与组织发育及损伤后修复，能诱导肺泡上皮细胞向间质转化［3］.研究发现肺炎支原体肺炎与TGF-β1密切相关［4］.因此本实验采用分子生物学方法研究桔梗抗MP有效部位对感染大鼠的肺组织中TGF-β1 mRNA的影响，探讨其可能的作用机制.

1　实验材料

1.1实验动物及菌株

健康Wistar大鼠，雌雄各半，体重80～100 g，实验动物购自长春亿斯实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（吉）2011-0004.肺炎支原体国际标准株（ATCCFH15531，购自美国菌种保藏中心）.

1.2药物与试剂

桔梗饮片（安国市奉义中药饮片有限公司，生产批号20130122，经黑龙江省中医药科学院王伟明研究员鉴定为桔梗药材）；阿奇霉素胶囊（北京四环制药有限公司，生产批号20130603）.PPLO（美国BD公司），苏木伊红染液（南京建成生物工程研究所有限公司），无水乙醇（分析纯）（天津市博迪化工有限公司），TRIzol试剂（美国Invitrogen公司），Transcriptor first strand cDNA Synthesis Kit （Roche公司），FastStart Universal SYBR Green Master（ROX）（Roche公司），大鼠TGF-β1引物：上游5'-GGCGGTGCTCGCTTTGTA-3'，下游5'-GCCACTCAGGCGTATCAG-3'，内参β-actin：上游5' -CGTTGACATCCGTAAAGAC-3'，下游5'-TGGAAGGTGGACAGTGAG-3'（哈尔滨博仕生物技术有限公司）.

1.3主要仪器设备

DL-CJ-1W生物净化工作台（北京东连哈尔仪器制造有限公司），MDF-382E-80℃低温冰箱（日本三洋公司），Milli-Q Reference system自动双重纯水蒸馏器（MILLI-Q），2、20、200μL微量加样器（Eppendoff公司），SorvaⅡ ST16低温离心机（Thermo公司），Infinite M200 Pro酶标仪（Tecan公司），9600荧光定量PCR仪（杭州博日有限公司）.

2　实验方法

2.1桔梗有效部位的提取

桔梗饮片加10倍体积75%乙醇，加热回流提取2次，每次2 h，滤过，合并滤液.滤液减压回收乙醇至稠膏状，得桔梗提取物.用AB-8大孔吸附树脂柱对桔梗提取物进行分离，依次以4倍柱体积的水、25%、50%、75%、95%乙醇洗脱.将50%乙醇洗脱液减压回收，即得桔梗有效部位.

2.2MP的培养和菌数测定

吸取1 mLMP标准菌株液加至9 mL含20%胎牛血清，10%酵母的2.1%PPLO液体培养基中，充分混匀后，置于37℃恒温箱内培养，每日观察.如培养基的颜色由红色变为黄色且液体澄清，则表明支原体培养为阳性.将待测菌液用MP培养基以10倍稀释法逐管稀释成101～1010系列浓度，经37℃培养后，以发生颜色变化的最高稀释浓度作为颜色改变单位（CCU），菌液浓度以CCU/mL 计.测得菌液浓度为106CCU/mL.

2.3分组、造模及给药

大鼠饲养1周后，挑取健康者60只，按体重和性别随机分成6组：①正常对照组；②模型组对照组；③阿奇霉素组；④桔梗有效部位高剂量组；⑤桔梗有效部位中剂量组；⑥桔梗有效部位低剂量组，每组10只，雌雄各半.腹腔注射戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，空白对照组滴入MP液体培养基，其余各组大鼠匀用含106 CCU/mLMP的培养基以滴鼻法［5］感染1次，每次50μL.感染后第2天，各组大鼠进行灌胃给药.阿奇霉素组第1天剂量加倍为：32 mg·kg-1·d-1，第二天到第五天剂量：16 mg·kg-1·d-1，每日1次，共连续给药5 d桔梗有效部位高剂量组：56 mg·kg-1·d-1，中剂量组：28 mg·kg-1·d-1，低剂量组：14 mg·kg-1·d-1，空白组和模型组给予相应剂量的生理盐水，每日1次，连续给药10 d.用药治疗期间各组大鼠每日自由进食、饮水.逐日观察其活动、进食等情况.

2.3HE染色

末次给药1 h后，戊巴比妥钠麻醉处死大鼠.剪取左肺组织相同部位，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，切片在二甲苯和不同浓度乙醇中浸泡，苏木素-伊红染色（HE），在光学显微镜下观察各组大鼠肺组织的病理改变情况.剪取右肺组织中叶，放入无RNA酶的冻存管中，-80℃保存，备用.

2.4SYBR荧光实时定量PCR

采用TRIzol法提取总RNA，反转录合成cDNA.逆转录反应：逆转录条件：25℃10 min，50℃60 min，获得的cDNA-20℃保存，备用.PCR反应条件：95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃复性60 s，共40个循环.反应结束仪器自动生成CT（threshold cycles）值及熔解曲线图.每个样本设3个重复管，同时设无模板阴性对照.

2.5统计学处理

采用2-ΔΔCt公式，相对定量的方法进行计算，得出TGF-β1和β-actin的相对表达量.计量数据以±S表示，运用SPSS19.0软件进行单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义.

图1　各组小鼠的肺组织病理检测（HE×40）

3　实验结果

3.1外观表现观察

空白组大鼠皮毛光泽，呼吸平稳，进食、活动正常；模型对照组呼吸急促不畅，大鼠鼻周见分泌物，偶有血丝，舌质暗，肺部出现明显的肺湿呼吸音，进食及活动减少；阳性药对照组状态有所好转，未见咳嗽等呼吸系统症状；桔梗高剂量组和中剂量组，大鼠皮毛较为光泽，精神状态较好；桔梗低剂量组大鼠活动少，进食少，大便略稀，鼻周围可见分泌物.

3.2各组肺组织病理学改变

空白对照组大鼠的肺组织结构正常，无间质性肺炎改变，仅个别偶有淋巴样细胞浸润；模型对照组大鼠的肺组织呈重度或中度炎症病变，肺泡间质隔增宽，支气管周围与肺泡间隔内毛细血管明显充盈，淋巴细胞及个别单核细胞有不同程度浸润现象，间质呈明显的炎症改变，造模成功；阿奇霉素组炎症反应减轻，淋巴细胞和巨噬细胞浸润减少；桔梗有效部位高剂量组间质性炎症减轻，与空白组相似；中剂量组少量淋巴细胞和巨噬细胞浸润在支气管和肺血管周围及肺泡间隔，较轻的间质性炎症，低剂量组仍可见间隔增宽，呈炎症改变.见图1.

3.3桔梗有效部位对TGF-β1 mRNA表达的影响

由表1可见，与空白对照组相比，模型组TGF -β1的mRNA的表达量明显增多（P＜0.01）；与模型对照组相比，阿奇霉素组和桔梗有效部位高、中剂量组能显著地降低TGF-β1的mRNA的表达（P＜0.05），低剂量组也可降低TGF-β1的mRNA的表达，但差异无统计学意义.

表1　桔梗有效部位对TGF-β1 mRNA表达的影响（±S）

表1　桔梗有效部位对TGF-β1 mRNA表达的影响（±S）

注：与空白组比较，△P＜0.01；与模型组比较*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别　n　TGF-β1 10　4.10±0.36 10　1模型对照组　10　4.75±0.64△阿奇霉素组　10　2.50±0.41＊＊桔梗有效部位高剂量组　10　2.58±0.49＊＊桔梗有效部位中剂量组　10　3.60±0.73*桔梗有效部位低剂量组空白对照组

4　讨论

MP是一类无细胞壁、可通过细胞过滤器、能在无生命的培养液中生长的最小原核细胞微生物.感染MP引发的MPP占小儿肺炎的20%左右，在密集人群可达50%.目前，MPP的发病机制并不完全清楚，主要有免疫学发病机制、呼吸道上皮细胞吸附、支原体直接侵入学说和毒素作用等学说［6］，其中免疫学方面研究较多.MP可刺激淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞等释放多种细胞因子，TGF-β1是其中一种，这些细胞因子与肺组织损伤修复有着重要的关系.肺泡Ⅱ型上皮细胞（alveolar epithelial cell type II，AEC II）是肺泡上皮的干细胞，呈立方形，位于肺泡角落，覆盖约5%的肺泡表面积，是合成和分泌肺泡表面活性物质的主要细胞，具有增殖分化成肺泡I型上皮细胞、肺水转运功能及肺固有免疫等多种功能.AEC II损伤后，上皮通透性增加，肺表面活性物质相关蛋白的合成和分泌降低，上皮细胞发生上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）［7］.研究报导TGF-β1在AEC II发生 EMT过程中起着非常重要的作用［8-9］.TGF-β1能够诱导肺泡上皮细胞向间质转化，引发间质性肺炎，严重者导致肺纤维化，作用通路与Smad信号转导途径相关［10］.TGF-β1与其受体结合后，激活受体性Smad2和Smad3，与共同通路性Smad4形成三聚体转位到核内，其本身可作为转录因子，也可诱导一些转录因子，与靶基因结合，从而调节“EMT”相关基因的表达，导致细胞间连接分散、细胞骨架重排和细胞移行，发生EMT过程.也有研究报道TGF-β1能激活非Smad介导的细胞信号途径［8］，包括 Rho、p-38MAPK、Ras、ERK、Notch、Wnt、NF-κB及PI3K途径，参与EMT过程.葛晓娜等认为，TGF-β1能够抑制上皮细胞增生，其表达升高可能减弱上皮细胞的再生能力，从而间接影响呼吸道的修复［11］.

中药治疗MPP的机理主要是抑制MP生长繁殖、提高机体免疫力、保护呼吸道上皮细胞等方面［12］.本研究以TGF-β1mRNA为指标，研究桔梗有效部位抗肺炎支原体可能的作用机制，这是本课题的创新点之一.

本实验研究发现模型组大鼠肺组织中TGF-β1的mRNA的表达明显高于空白对照组，阿奇霉素组和桔梗有效部位高、中、低剂量组降低了TGF -β1的mRNA的表达，其中阿奇霉素组和桔梗有效部位高剂量组降低TGF-β1的mRNA的表达最为显著.说明桔梗有效部位抗MP的作用与TGF-β1有关.其作用机制可能是通过下调TGF-β1的mRNA的表达，抑制EMT的过程，以达到修复肺泡上皮细胞的作用.

综上所述，桔梗有效部位对大鼠MP感染致肺损伤的作用机制可能是通过下调TGF-β1的水平，从而抑制EMT的过程修复肺泡上皮细胞，改善肺损伤.对于TGF-β1作用机制有待于进一步深入研究.

［1］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典（一部）［M］.北京：中国医药科技出版社，2010.259.

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Effects of active parts isolated from Platycodon grandiflorum on expression of TGF-β1mRNA in rats infected with mycoplasma pneumoniae

DONG Kun1，SUIWen-xia1，YAO Lin2，SUIMei-jiao2，KOU Han-xu1，MA Ying-li1
（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，School of Pharmacy，Harbin 150040，China；2.Heilongjiang Academy of Chinese Medical Sciences，Harbin 150036，China）

To investigate the effects of active parts isolated from Platycodon grandiflorum on the expression of TGF-β1 mRNA in rats infected with mycoplasma pneumonia.Themodel of rats infected with mycoplasma pneumoniae was established by nasal drip to observe the pathological changes extent of rats’lung tissue by lightmicroscope.The levels of TGF-β1 mRNA in pulmonary tissueswere determined with RT-PCR.Results showed that the control group rats’lung tissue structure were normal；model group rats’showed severe ormoderate inflammatory lesions，which predicted buildingmodel success；drug groups can reduce the lung inflammation and the lung tissue lesions were improved.TGF-β1 mRNA of the model group significantly increased than the coutrol group；medicated groups can reduce the expression of TGF-β1 mRNA，while the effect of positivemedicine group and the high dose group were better than others.The anti MP mechanism of Platycodon grandiflorum active partswas associated with downregulation of the expression of TGF-β1 mRNA and inhibiting the process of epithelial-mesenchymal transition.

Platycodon grandiflorum；mycoplasma pneumoniae；transforming growth factor -beta 1；RT-PCR

R285

A

1672-0946（2016）02-0142-04

2015-03-25.

哈尔滨市科技创新人才研究专项资金项目（项目编号：2012RFQYS041）.

隋文霞（1988-），女，硕士，研究方向：中药活性成分的机理研究.

马英丽（1954-），博士，教授，博士生导师，研究方向：中药活性成分的机理研究.