张桂枝，邢启银，靳双星

（河南牧业经济学院畜牧工程系，河南 郑州 450046）

复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡红细胞免疫功能的影响

张桂枝，邢启银，靳双星

（河南牧业经济学院畜牧工程系，河南 郑州 450046）

为考察复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡免疫功能的影响，试验选取健康AA肉鸡400只，随机分成5组，每组设5个重复。试验鸡在新城疫活疫苗（LaSota株）免疫时分别应用复方中药制剂和复方中药混菌发酵制剂连用7 d，并于14、28日龄分别进行白细胞、淋巴细胞计数和测定T－淋巴细胞阳性率、免疫器官指数及新城疫抗体效价等免疫指标。结果与空白对照组相比，复方中药混菌发酵制剂可显著或极显著提高鸡的白细胞、淋巴细胞数量，T-淋巴细胞阳性率、免疫器官指数和新城疫抗体水平（P<0.05或P<0.01）;与药物对照组相比，复方中药混菌发酵制剂中、高剂量组可显著提高淋巴细胞数量、免疫器官指数和新城疫抗体水平（P<0.05），复方中药混菌发酵制剂用药剂量可以减半使用。表明复方中药混菌发酵制剂能显著地促进肉鸡淋巴细胞的增殖、免疫器官发育和疫苗抗体的产生，增强机体的免疫功能。

复方中药；发酵；肉鸡；免疫

中草药及其制剂因其具有安全、高效、低毒、价廉、不易产生耐药性等优点，在动物疫病防控中发挥着越来越大的作用[1-2]。近年来，通过微生物发酵手段炮制中药的研究越来越受到重视，并取得了一定进展。应用微生态菌发酵中药，可集发酵中药制剂和微生态制剂双重功能，其临床效果优于常规微生物发酵制剂和单一的中药制剂，是现代生物技术和中药研究的完美结合，成为中药的研究与开发的新热点。因此，本课题组成员根据中兽医理论及养殖业生产实际需要科学组方，研制出复方中药混菌发酵制剂。为进一步阐明它增强免疫作用的机制，通过在饲料中添加不同剂量的复方中药混菌发酵制剂，测定AA肉鸡的免疫细胞数量、免疫器官脏器指数、疫苗免疫后抗体效价等变化规律，探讨复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡免疫功能的影响，旨在为临床应用及生产实践提供参考。

1　材料与方法

1.1试验样品复方中药制剂：由连翘、黄芪、板蓝根、茯苓、白术、枳实、山楂、甘草等8味中药组成。分别于50℃～60℃下烘干2～3 h，粉碎，100%过80目筛，备用。复方中药混菌发酵制剂：取上述复方中药制剂调整物料含水量为50%，pH值为6.0左右，使枯草芽孢杆菌：产朊假丝酵母：嗜酸乳杆菌=1∶1∶1，混匀后，按4%接种量接入饲料中，搅拌均匀后装入不透气的塑料袋中，压实，封口，置于31℃的环境中培养72 h，烘干，即得。

1.2试验动物与设计1日龄健康AA肉鸡，隔离饲养至7日龄，选取400只体重相近健康的肉仔鸡，随机分为5组，每组设5个重复，每个重复16只鸡，分笼饲养，自由采食和饮水，试验期间各组饲养管理条件一致。Ⅰ组为空白对照组，不用药；Ⅱ组为复方中药制剂组，饲料中添加1%复方中药制剂，为药物对照组；试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组，在饲料中分别添加0.5%、1.0%、1.5%的复方中药混菌发酵制剂。分别于免疫前1d用上述药物，连续用药1周。免疫程序：5组鸡均在7日龄1.5倍量点眼滴鼻接种新城疫活疫苗（LaSota株）；21日龄3倍量饮水接种新城疫活疫苗（LaSota株）。

1.3主要试剂鸡淋巴细胞分离液（天津灏洋生物制品有限公司生产）。新城疫（ND）标准浓缩抗原、ND标准阳性血清（购自中国兽医药品监察所）。鸡新城疫活疫苗（LaSota株）（齐鲁动物保健品有限公司）。

1.4主要仪器显微镜、恒温培养箱、离心机、微型振荡器、96孔V型反应板、微量移液器等。

1.5检测指标及测定方法

1.5.1白细胞分类计数采用常规方法[3]。

1.5.2T-淋巴细胞阳性率的测定采用酸性α-醋酸萘酯酶（ANAE）染色法，计算T淋巴细胞ANAE阳性细胞百分率[4]。

1.5.3免疫器官指数测定于14、28日龄，每重复随机抽取2只体重相近健康的AA肉鸡，每个处理组共选10只鸡，分别称重，颈静脉放血致死，迅速摘取胸腺、脾脏和腔上囊，进行称重并计算其免疫器官指数。免疫器官指数=免疫器官重量（g）/试验阶段体重（kg）。

1.5.4抗体效价测定分别在7、14、28日龄，每重复随机抽取2只体重相近健康的AA肉鸡，每个处理组共选10只鸡，采血，分离血清，采用微量红细胞凝集抑制（HI）试验对血清样品进行ND抗体测定，以完全抑制4个血凝单位抗原的血清最高稀释倍数作为抗体效价，用nlg2来表示。

1.6统计分析试验数据采用SPSS 12.0中One-Way ANOVA过程进行单因素方差分析，并进行Duncan′s多重比较，以P<0.05作为差异显著性判断标准，结果以平均值±标准差表示。

2　结果与分析

2.1复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡白细胞总数的影响由表1可知，复方中药制剂组和复方中药混菌发酵制剂高、中、低剂量在14日龄、28日龄均能显著提高其白细胞总数，即Ⅱ组、试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组与对照组比较差异显著（P<0.05）；试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组与Ⅱ组比较差异不显著（P>0.05）。试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各组之间比较差异不显著（P> 0.05）。说明日粮中添加复方中药混菌发酵制剂和复方中药制剂均能显著提高鸡新城疫免疫期间的白细胞数量。

表1　复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡白细胞数量的影响（×109/L）

2.2复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡淋巴细胞数量的影响表2结果表明，复方中药制剂组和复方中药混菌发酵制剂高、中、低剂量在14日龄、28日龄均能显著提高其淋巴细胞数量。药物对照Ⅱ组、试验Ⅲ与对照组比较差异显著（P<0.05），试验Ⅳ、Ⅴ组与与对照组比较差异极显著（P< 0.01），Ⅱ组、Ⅲ组与Ⅳ、Ⅴ组比较差异显著（P< 0.05）；Ⅱ组与Ⅲ组以及Ⅳ与Ⅴ组之间比较差异不显著（P>0.05）。说明免疫期间以1%剂量添加复方中药制剂和以0.5%剂量添加复方中药混菌发酵制剂可显著提高鸡的淋巴细胞的数量；以1% 或1.5%剂量添加复方中药混菌发酵制剂能极显著提高肉鸡的淋巴细胞的数量。

表2　复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡淋巴细胞数量的影响（×109/L）

2.3复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡T-淋巴细胞阳性率的影响由表3结果可知，复方中药制剂组和复方中药混菌发酵制剂高、中、低剂量在14日龄、28日龄均能显著提高其T淋巴细胞阳性率。药物对照Ⅱ组、试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组与对照组比较差异显著（P<0.05）；试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组与Ⅱ组比较差异不显著（P>0.05）。试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各组之间比较差异不显著（P>0.05）。说明日粮中添加复方中药混菌发酵制剂和复方中药制剂均能显著提高鸡新城疫免疫期间的T-淋巴细胞阳性率。

表3　复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡T-淋巴细胞阳性率的影响/%

2.4复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡免疫器官指数的影响由表4可知，14日龄，药物对照Ⅱ组、试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组胸腺指数极显著高于对照组（P<0.01）；Ⅳ、Ⅴ组腔上囊指数显著高于对照组和Ⅱ、Ⅲ组（P<0.05）；Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组脾脏指数显著高于对照组（P<0.05），而Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ之间差异不显著（P>0.05）。28日龄，试验Ⅳ、Ⅴ组胸腺指数和脾脏指数极显著高于对照组（P<0.01），显著高于Ⅱ、Ⅲ组（P<0.05），Ⅱ、Ⅲ组显著高于对照组（P<0.05）。Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组腔上囊指数显著高于对照组（P<0.05）。说明日粮中添加复方中药混菌发酵制剂和复方中药制剂均能显著提高肉鸡免疫器官指数。

表4　复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡免疫器官指数的影响　（g/kg）

2.5复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡新城疫疫苗免疫效果的影响由表5可知，复方中药制剂组和复方中药混菌发酵制剂高、中、低剂量组在7日龄免疫前新城疫抗体效价差异不显著（P> 0.05），在14、28日龄均能显著提高新城疫抗体效价。药物对照Ⅱ组、试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组与对照组比较差异显著（P<0.05）；14日龄时，试验Ⅴ组与药物对照Ⅱ组比较差异显著（P<0.05）。试验Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ各组之间比较差异不显著（P>0.05）。说明日粮中添加复方中药混菌发酵制剂和复方中药制剂均能显著提高鸡新城疫免疫期间的新城疫抗体效价。

表5　复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡新城疫疫苗免疫效果的影响　（lg2）

3　讨论

3.1本复方中药混菌发酵制剂是由连翘、板蓝根、黄芪、甘草、茯苓、白术、枳实、山楂等中药组成。黄芪、白术补中益气，茯苓健脾利水，板蓝根、连翘扶正祛邪，枳实破积行气，山楂消食健脾，甘草调和诸药。因此，此方具有补中益气，健脾和胃，兼以清热解毒、消导理气的作用。发酵是中药炮制的一种重要手段和方法，利用微生物强大的分解转化物质的能力，达到提高中药药效、改变药性、扩大适应症、降低毒副作用的目的。现代药理研究表明，方中黄芪、板蓝根、茯苓、白术、甘草及连翘等都具有免疫增强作用，能显著促进鸡免疫器官的发育和免疫活性细胞的生成，并可增加血液中白细胞总数，促进嗜中性粒细胞和巨噬细胞的吞噬功能，增强细胞免疫和体液免疫[5-7]。

3.2外周血白细胞总数的变化反映了各种白细胞数量的变化，可以作为检验机体免疫功能变化的一个重要指标。细胞免疫应答主要依赖于T淋巴细胞[4]。本研究结果表明，复方中药混菌发酵制剂在14、28日龄可以显著或极显著地提高肉鸡血液中白细胞数量、淋巴细胞数量和T淋巴细胞阳性率，并维持在高水平。在复方中药混菌发酵制剂对AA肉鸡淋巴细胞数量的影响研究中发现，日粮中添加1%复方中药制剂组与1%和1.5%复方中药发酵制剂组相比有显著差异，与添加0.5%复方中药发酵制剂组相当，说明复方中药制剂经混菌发酵后其药效明显增强，这可能与有益微生物利用中药成分作为营养物质进行生长、繁殖和代谢，在此过程中分泌的蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶等胞外酶，使植物细胞壁破裂，从而利于中药有效成分从胞内释放有关。研究结果证明，复方中药混菌发酵制剂具有显著促进免疫细胞的分裂、增殖、活化作用，能加速机体细胞免疫的发育和完善。

3.3Rivas等[8]认为胸腺、脾脏、腔上囊的重量可用以评价雏鸡的免疫状态，其绝对重量和相对重量的变化可以反映机体内细胞免疫和体液免疫机能。因此，通过测定免疫器官指数，可从生长发育角度评价机体免疫状态和免疫能力[9]。试验结果表明，饲料中添加一定剂量的复方中药混菌发酵制剂可显著提高肉鸡胸腺、腔上囊和脾脏指数，这与谢红兵[10]、葛剑[11]等报道的结果基本一致。说明本复方中药混菌发酵制剂可促进肉鸡淋巴器官的生长发育和迅速成熟。比较研究结果发现，在日粮中添加1%复方中药制剂与1%和1.5%复方中药混菌发酵制剂组相比有显著差异，进一步验证了发酵可促进中药药效的增强。

3.4体液免疫是由抗原刺激B淋巴细胞，引起B淋巴细胞活化、增殖与分化，形成浆细胞并产生抗体，抗体效价的变化反映机体的体液免疫状态。本试验结果表明，复方中药混菌发酵制剂在不同程度上提高鸡血清ND抗体效价，说明该复方中药混菌发酵制剂有明显增强新城疫疫苗免疫效果的作用。

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S853.72

B

0529-6005（2016）07-0052-03

2015-06-02

河南省科技攻关计划项目（142102110044）；河南牧业经济学院科技创新团队项目（HUAHE2015003）

张桂枝（1970-），女，副教授，硕士，从事畜禽疫病防治的教学与科研工作，E-mail：zhangguizhi666@126.com

靳双星，E-mail：jinshuangxing@126.com