张艳超史永刚卫佳欢杜臻嘉钟钰胡大伟王旸

（1.增城出入境检验检疫局　　广东增城　511340；2.河源出入境检验检疫局）

3种方法检测食品中沙门菌能力验证结果分析

张艳超1史永刚1卫佳欢1杜臻嘉1钟钰1胡大伟1王旸2

（1.增城出入境检验检疫局广东增城511340；2.河源出入境检验检疫局）

为了提高实验室的检测能力和技术水平，确保检测结果准确，采用GB 4789.4-2010、mini VIDAS、沙门菌显色培养基3种方法对3年来参加沙门菌的8个能力验证测试结果进行比对分析，结果显示采用3种方法能准确鉴定出测试样品中沙门菌，取得满意结果。因此，以国标法为基准，优先选用CHRO和BS平板，XLD和HE做参照，同时使用mini VIDAS进行快速筛查，3种方法有机结合，综合判断，可确保检测结果的准确。

GB 4789.4-2010；mini VIDAS；沙门菌显色培养基

1　　前言

沙门菌属于革兰氏阴性菌，是最常见的人畜共患型食源性致病菌之一。我国2001年食品主动监测结果显示，在7大类食品（生肉、熟肉、生奶、冰激淋、酸奶、水产品和蔬菜）中，沙门菌的检出率最高［1］。食品中沙门菌引起的食源性疾病已受到世界的广泛关注，我国食品安全国家标准中规定各类食品中不得检出沙门菌。

食品中沙门菌的检测技术是预防与控制的关键技术环节，而能力验证是利用实验室间的比对确定实验室的校准/检测能力或检查机构的检测能力［2］，它是评定实验室技术能力的重要手段之一，也是实验室外部质量控制保证，试验结果的准确性关系到实验室的工作技术能力水平。为了提高实验室的检测能力和技术水平，增城出入境检验检疫局实验室从2012年以来共参加5次沙门菌的能力验证活，采用国标 《食品微生物学检验沙门氏菌检验方法》（GB 4789.4-2010）［3］、mini VIDAS、沙门菌显色培养基3种方法对测试样品进行检测分析，取得满意结果。现将3种方法分离和鉴定沙门菌进行总结和分析。

2　　材料与方法

2.1材料

2.1.1培养基和试剂

缓冲蛋白胨水（BPW）、四硫磺酸钠煌绿增菌液（TTB）、亚硒酸盐胱氨酸增菌液（SC）、HE琼脂、亚硫酸铋琼脂（BS）、三糖铁琼脂（TSI）、生化试剂等：购自广州环凯生物有限公司；沙门菌显色培养基（CHRO Magar）：郑州博赛科玛嘉生产；试剂盒：法国生物梅里埃生产，经标准菌株验证与结果相符；沙门菌多价诊断血清（A-F群）：宁波天润生产，经标准菌株验证，结果相符。

2.1.2主要仪器设备

Mini VIDAS全自动荧光免疫分析仪：法国生物梅里埃公司；DNP-9272恒温培养箱：上海精宏实验设备有限公司；CX-31显微镜：日本奥林巴斯；GR110DF全自动高压蒸汽灭菌器：致微（厦门）仪器有限公司；BSC-1500ⅡA2-X生物安全柜：济南鑫贝西生物技术有限公司。

2.1.3试验样品

5次能力验证试验的8个样品均由组织方发放，其中6份冻干粉，2份营养琼脂斜面培养物。

2.2方法

2.2.1国标方法

按照组织方提供的《参试指导书》进行水化，振摇充分混匀，全部样品混悬液作为一个整体样品，按照GB 4789.4-2010进行前增菌、选择性增菌、分离培养、生化试验、血清学凝集试验。

2.2.2mini VIDAS全自动荧光免疫分析仪

分别从TTB和SC两种选择性增菌液中移取1 mL加入到小试验中，置沸水浴中灭活1 min，吸取灭活的增菌液0.5 mL，加入试剂条中，按照仪器使用规程进行上机操作。

2.2.3沙门菌显色培养法

按照培养基使用说明书进行配制，倒平板，从样品原液、BPW增菌液、TTB和SC增菌液中分别取一环划平板，36℃培养24 h，观察菌落形态。挑取可疑菌落进行生化试验、血清学凝集试验。

3　　结果与分析

3.1试验结果

试验结果见表1。

表1　　试验结果汇总表

表1结果显示，5次试验8个样本共检出沙门菌阳性结果5次，阴性结果3次，试验结果全部为满意。

3.2样品前处理

5次能力验证试验中，有4次参试指导书中规定了前处理方法，包括释释液的使用。稀释的目的是溶解样品和充分均匀，并使受损的细胞得以恢复。因为目标菌株在冻干和运输过程中容易受到损伤，在稀释时要充分混匀并静置0.5-1.0 h，以使受损菌株得以恢复［4］。如表1所示，除2012年的营养琼脂斜面未使用稀释液外，其他6份冻干粉均使用稀释液溶解，分别采用生理盐水、缓冲蛋白胨水、1%蛋白胨水等溶解，这3种稀释液均能够使受损细胞得以恢复，溶解效果良好，无出现假阴性结果。

3.3平板的选择

国标方法使用BS琼脂平板和XLD、HE、CHRO 3种中任一种进行分离鉴定。BS琼脂平板选择性比较强，24 h目标菌生长不好，需要延长培养时间至48 h；弗氏柠檬酸杆菌等一些产硫化氢、不发酵乳糖的菌在XLD和HE琼脂平板和沙门菌形态相似；CHRO对沙门菌和肠杆菌科其他菌分离效果明显，对分离鉴别可疑菌起着关键作用。4种选择性平板的分离效果见表2。

表2　4种选择性平板分离效果比较

表2显示，5个阳性样品中，有4个样品在BS、CHRO上菌落特征明显，容易识别和区分；3份阴性样品在XLD、HE上的菌落特征和沙门菌相似，在CHRO上为蓝色菌落。因此，在选择平板时，优先选用CHRO和BS，XLD和HE做参照。特别需要指出的是，亚利桑那菌在CHRO上是蓝色菌落，周围有紫色晕圈，其他沙门菌在CHRO上是紫红色。这使得亚利桑那菌在CHRO上与非沙门菌容易混淆，也最容易遗漏，增加了鉴定的难度。所以没有任何一种培养基可以保证各种沙门菌血清型生长，在日常检验中，为减少假阴性结果，同时使用两种或两种以上培养基进行平行试验完全必要［5］。

3.3mini VIDAS全自动荧光免疫分析仪

在8个样品中，mini VIDAS初筛结果与指定值全部一致，见表3。

表3VIDAS初筛结果汇总表

一般情况下，在二次选择性增菌后再进行VIDAS初筛。测试的8个能力验证样品在BPW增菌后，也进行了VIDAS初筛，试验结果与二次增菌结果一致，只是相对荧光值较二次增菌测试值低，说明TTB和SC对干扰菌有明显抑制作用，有利于目标菌生长。BPW不含抑制剂，干扰菌和目标菌均生长，由于干扰菌快速生长，在一定程度上会抑制目标菌的生长。在日常食品的沙门菌检测中，要选择从TTB或SC增菌中进行VIDAS初筛，确保检测结果的准确性。mini VIDAS检测的特点是只要增菌液存在目标菌，不需纯培养即可检出，而常规培养法必须对目标菌进行纯培养才易检出。

3.4生化试验和血清凝集

国标方法是依靠生化反应和血清学反应对沙门菌进行检验鉴定，如表4所示。典型的沙门菌在赖氨酸脱羧酶肉汤上为赖氨酸脱羧酶阳性反应、三糖铁琼脂为K/A、产气阳性、硫化氢阳性、靛基质阴性、尿素阴性、氰化钾阴性。在5个阳性结果中，生化反应全部为典型沙门菌属。在进行血清学鉴定时，除C058样品A-F多价不凝集，其余4个阳性样品AF多价全部凝集。C058样品为O13凝集和O22凝集，补充生化实验卫矛醇阴性、山梨醇阳性、水扬苷阴性、ONPG阳性、丙二酸盐阳性，鉴定为亚利桑那菌。能引起人类疾病的绝大数属于A-E组，主要有猪霍乱沙门菌、鼠伤寒沙门菌等10多个血清型［6］，亚利桑那菌为沙门菌Ⅲ生化群，血清型较特殊，对于基层实验室，很少配备完整沙门菌血清，遇到这种情况时，需要参考多种方法进行判断，如VIDAS初筛结果。

表4　　能力验证样品生化结果一览表

4　结论

能力验证结果分析表明，国标法是经典的检测方法，但检测周期长，过程复杂。在能力验证中，组织方添加了奇异变形杆菌、弗氏柠檬酸杆菌和产气肠杆菌等作为干扰菌，菌落形态在XLD，BS和HE等平板上与沙门菌相似，增加鉴定的难度；而CHRO是利用酶反应显色［5］，沙门菌在其平板上为紫红色菌落，但亚利桑那菌较特殊，为蓝色菌落。沙门菌显色培养基选择性好，特异性强，可快速区别干扰菌的干扰。mini VIDAS检测的特点是快速，简单，灵敏度高，不需纯培养即可检出。在检测能力验证的8个样品中，mini VIDAS试验结果与最终结果一致。在日常检验中，为减少假阴性结果，要以国标法为基准，优先选用CHRO和BS平板，XLD和HE可做参照，同时使用mini VIDAS进行快速筛查。3种方法有机结合，综合判断，可确保检测结果的准确性。

［1］王茂起，冉陆，王竹天，等.2001年中国食源性致病菌及其耐药性主动监测研究［J］．卫生研究，2004，33（1）：49-54.

［2］CNAS-RL02：2010能力验证规则［S］.

［3］GB 4789.4-2010食品微生物学检验沙门氏菌检验［S］.

［4］鞠慧萍，孙鹏翔，苏粉良.食品能力验证样品中沙门氏菌的分离及鉴定［J］.农产品加工学刊，2014，361（15）：48-49.

［5］杨娟，许美玲，张丽，等.五种方法检测食品中沙门氏菌的结果比较［J］.中国食物与营养，2013，19（9）：18-20.

［6］李庆德，原志伟，沈巍.沙门氏菌的危害及其快速检测方法的研究进展［J］.湖北畜牧兽医，2010，1：10-12.

［7］SN 0170-1992出口食品沙门氏菌属（包括亚利桑那菌）检验方法［S］.

Analysis on the Results of the Proficiency Testing on the Three Methods Detecting Salmonella in Foods

ZHANG Yanchao1，SHI Yonggang1，WEI Jiahuan1，DU Zhenjia1，ZHONG Yu1，HU Dawei1，WANG Yang2
（1.Zengcheng Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Zengcheng，Guangdong 511340；2.Heyuan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau）

To improve the detection proficiency and technological level of laboratory and ensure the accuracy of detection result，three methods GB 4789.4-2010，mini VIDAS and salmonella chromogenic medium are employed for comparative analysis on the 8 results of the proficiency testing over the 3 past years.Results showed that the salmonella in the samples could be identified accurately with the 3 methods and the results were satisfactory.With the GB method as the standard，the CHRO plate and BS plate are first chosen，and XLD and HE methods can be used as reference.The mini VIDAS can be used simultaneously to conduct quick screening.The combination of the three methods and a synthetic judgment ensure the accuracy of the detection result.

GB 4789.4-2010；Mini VIDAS；Salmonella Chromogenic Medium

TS207.4

E-mail：zhangych09@163.com

2015-11-04