陈 杰，田知利，胡 江，*，罗玉柱，刘 秀，王继卿，石红梅2，雷俊杰2（.甘肃农业大学动物科学技术学院/甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃兰州730070；2.甘南州畜牧科学研究所，甘肃 合作，747000）

牦牛CAPN1基因intron 1多态性及其与胴体和肉质性状的关联性

陈 杰1，田知利1，胡 江1，*，罗玉柱1，刘 秀1，王继卿1，石红梅2，雷俊杰2
（1.甘肃农业大学动物科学技术学院/甘肃省草食动物生物技术重点实验室，甘肃兰州730070；2.甘南州畜牧科学研究所，甘肃 合作，747000）

采用PCR-SSCP技术检测甘南牦牛、天祝白牦牛及大通牦牛钙蛋白酶1（CAPN1）基因单核苷酸多态性（SNPs），并分析SNPs对甘南牦牛部分胴体及肉质性状的影响。结果表明，3类群牦牛在CAPN1基因第1内含子区检测到g.100+606G＞T突变，形成了AA、BB和AB 3种基因型，检测区域表现为中度多态；CAPN1基因第1内含子突变影响不同年龄段甘南牦牛肌肉嫩度、失水率和眼肌面积，AA基因型个体嫩度剪切力值较低而眼肌面积较高，其中3岁和5岁牦牛AA型个体嫩度剪切力显著低于BB或AB型（P＜0.05），4岁和5岁牦牛AA型个体眼肌面积显著高于BB或AB型（P＜0.05）；另外6岁牦牛AA型个体失水率显著高于BB 和AB型（P＜0.05）。CAPN1基因g.100+606G＞T突变可用为甘南牦牛此类性状潜在的遗传标记之一。

甘南牦牛；CAPN1基因；多态性；胴体和肉质性状

牛肉品质反映肉牛生产性能。评价牛肉品质的指标主要包括风味、嫩度和多汁性等，而决定牛肉品质的最重要因素则是嫩度［1］，Doumit等［2］报道，嫩度剪切力值小于4.1 kg·f的牛排能使98%消费者感到满意。钙蛋白酶（Calpain）也称CAPN（calcium activated neutral protease），是存在所有脊椎动物细胞中的半胱氨酸巯基内肽酶，在神经发育、肌肉生长、成肌细胞融合与分化、信号传导、细胞凋亡及膜蛋白裂解等方面有重要作用［3］。自Guroff［4］首次发现CAPN基因至今，已有14个CAPN基因被克隆鉴定［5］。CAPN1属钙蛋白酶家族，是降解肌原纤维蛋白重要的蛋白酶，肌肉嫩度与CAPN1活性调节有关。金海丽等［6］认为可以通过基因调控技术抑制钙蛋白酶的活性，从而达到提高肌肉生长的目的。Koohmaraie等［7］证明了蛋白酶水解系统中只有钙蛋白酶与肌肉嫩化有关联，后又证明了与肌肉嫩化相关的钙蛋白酶的主要是CAPN1。Melody等［8］发现猪肉嫩度、系水力与蛋白质降解、CAPN1的活性和自溶有关；Pringle等［9］发现牛肉嫩度和CAPN1的活性相关，并不明显与钙蛋白酶抑制蛋白（CAST）活性有关联，而CAPN1与CAST活性比值与嫩度高度相关。Smith等［10］将CAPN1基因作为牛肉嫩度候选基因。Morris等［11］证实了CAPN1基因可以作为嫩度的分子遗传标记选择之一。

试验采用了PCR-SSCP方法，分析甘南牦牛、天祝白牦牛及大通牦牛CAPN1基因intron 1的突变，分析该突变对甘南牦牛嫩度等性状的影响，从而寻找与牦牛肉质和胴体性状相关的遗传标记，充实牦牛胴体及肉质性状的遗传标记数据。

1 材料与方法

1.1 试验动物肉质性状测定

共采取了816头牦牛血样，其中甘南牦牛694头（甘南藏族自治州夏河县160头，甘南藏族自治州玛曲县534头），天祝白牦牛72头，大通牦牛50头。血样使用ACD抗凝剂抗凝并保存于-70℃。

记录采集血样的牦牛信息，包括牛编号、性别和年龄。从甘南牦牛眼肌部位采集肉样以测定肉质性状，其中嫩度用C-LM3型数显式嫩度仪测定剪切力值并参照《肉嫩度的测定 剪切力值测定法》（NY/T 1180—2006）进行校正。测定甘南牦牛宰后胴体质量，以及眼肌面积，其中眼肌面积测定时用硫酸纸描下胴体12～13肋骨间眼肌横断面，然后用求积仪测定其面积。测量失水率方法是将肉样置于35 kg压力仪5 min，肉样前后的质量差与加压前的质量比值则为失水率；熟肉率为将肉样于蒸锅加盖蒸30 min后，取出冷却2 h后的质量占蒸煮前质量百分比。

1.2 提取基因组DNA

基因组DNA的提取运用苯酚-氯仿法［12］从甘南牦牛血样中提取。

1.3 引物设计和PCR扩增

应用Primer 5软件并根据GenBank公布的牦牛CAPN1基因序列（登录号：NW_005393546）设计引物，扩增区域为牦牛CAPN1基因intron 1的部分序列。上游引物：5′-CCTTCCTCGTTCCTTGTGCTA-3′，下游 引物：5′-CCCAAGCCTGTGGTTTCC-3′。

PCR反应总体积20 μL：基因组 DNA 0.8 μL，上下游引物各0.8 μL，TaKaRa Premix Taq预混酶10.0 μL，ddH2O为7.6 μL。PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，63℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。

1.4 SSCP检测及等位基因序列测定

取3 μL的PCR产物，加入7 μL变性上样缓冲液（98%去离子甲酰胺、0.025%溴酚蓝、0.025%二甲苯氰、10 mmol·L-1EDTA），98℃变性10 min，迅速冰浴5 min后，上样到14%非变性聚丙烯酰胺凝胶（Acr∶Scr=39∶1），280 V电压、水循环温度18℃电泳18 h。然后用银染法［13］染色并判定基因型。

对等位基因为纯合型的个体进行测序，而对等位基因仅存在于杂合个体的则在SSCP条带切胶并重新扩增后再测序［14］。测序结果来自北京六合华大基因公司。

1.5 统计分析

应用SPSS 19.0统计软件中一般线性模型分析CAPN1基因第1内含子突变对甘南牦牛胴体及肉质性状的影响。随着年龄的增大，动物肌肉中结缔组织含量增多，致使肌肉嫩度下降［15］，所以对甘南牦牛群体分年龄段分析基因突变对肉质的影响。其统计模型为：

式中：Yijk为性状表型值，μ为群体均值；Genotypei为基因型效应；Genderj为性别效应；Allelei为等位基因效应；eijk为随机误差。

图1 不同基因型的牦牛CAPN1基因第1内含子PCRSSCP电泳图Fig.1 PCR-SSCP pattern of CAPN1 intron 1 region in yak

图2 牦牛CAPN1第1内含子基因序列对比Fig.2 Alignment of allelic sequences of intron 1 of CAPN1 in yak

2 结果与分析

2.1 牦牛CAPN1基因PCR-SSCP检测结果

图1为牦牛CAPN1基因PCR产物SSCP的电泳带型。在引物扩增区域发现2种SSCP带型，分别为等位基因A和B，形成AA、BB和AB 共3种基因型。

2.2 牦牛CAPN1基因等位基因序列比对

3类群牦牛CAPN1基因引物扩增区域各等位基因序列比对见图2。与GenBank下载的牦牛CAPN1基因序列（登录号：NW_005393546）比对，等位基因A存在g.100+606G＞T的突变。

2.3 牦牛CAPN1基因第1内含子区的多态性

牦牛CAPN1基因群体遗传多态性分析如表1所示。甘南牦牛和天祝白牦牛等位基因A和B频率基本一致，大通牦牛等位基因B为优势等位基因。

一般通过多态性信息含量（polymorphism information content，PIC）、纯合度（homozygosity，Ho）、遗传杂合度（heterozygosity，He）和有效等位基因数（effective number of alleles，Ne）衡量群体遗传多态性，进而估测群体的选择潜力。甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛CAPN1基因检测区域多态信息含量均为0.25＜PIC＜0.5，属中度多态。甘南牦牛和天祝白牦牛卡方值均显著（P＜0.01），偏离Hardy-Weinberg平衡状态。大通牦牛卡方值未达到显著水平（P＞0.05），处于Hardy-Weinberg平衡状态。

2.4 甘南牦牛CAPN1基因第1内含子区突变与胴体及肉质性状相关性

运用一般线性模型GLM对不同年龄甘南牦牛CAPN1第1内含子基因型与肉质性状关的联分析见表2。应用等位基因“缺失/存在”方法［16］分析等位基因对肉质性状的影响见表3。方差分析结果表明，CAPN1基因第1内含子突变对不同年龄甘南牦牛肉质性状有一定影响。天祝白牦牛和大通牦牛因为没有生产数据，所以不能做相关性分析。

表1 牦牛CAPN1基因第1内含子区遗传多态性分析Table 1 Genetic diversity in intron 1 of CAPN1 in yak

表2 甘南牦牛CAPN1第1内含子基因型与胴体及肉质性状关联分析Table 2 Association analysis of genotypes of CAPN1 intron 1 with carcass and meat quality traits in Gannan yak

表3 甘南牦牛CAPN1第1内含子等位基因与肉质性状关联分析Table 3 Association analysis of alleles of CAPN1 intron 1 with carcass and meat traits in Gannan yak

CAPN1基因第1内含子突变影响甘南牦牛肌肉嫩度。3～6岁牦牛AA型个体嫩度剪切力值均较低，其中基因型与3岁和5岁牦牛肌肉嫩度剪切力值显著相关（P＜0.05）。各基因型间多重比较表明，3岁牦牛AA型个体嫩度剪切力值显著低于BB和AB型（P＜0.05），5岁甘南牦牛AA和BB型个体嫩度显著低于AB型（P＜0.05）；3岁甘南牦牛携带等位基因A的个体嫩度剪切力值显著小于未携带个体（P＜0.05），而携带等位基因B个体嫩度显著大于未携带个体（P＜0.05）。

CAPN1基因第1内含子突变影响甘南牦牛眼肌面积。4～6岁牦牛AA型个体眼肌面积均较高，其中基因型与4岁和5岁牦牛眼肌面积显著相关（P＜0.05）。4岁牦牛AA型个体眼肌面积显著大于BB和AB型（P＜0.05），5岁牦牛AA型个体显著大于BB型（P＜0.05）。等位基因B对甘南牦牛眼肌面积有不利影响，携带等位基因B个体眼肌面积均低于未携带个体，其中4岁牦牛携带等位基因B个体眼肌面积显著低于未携带个体（P＜0.05）。

3～6岁牦牛AA型个体肌肉失水率均较高。其中CAPN1基因第1内含子突变与6岁牦牛失水率显著相关（P＜0.05），即AA型个体失水率显著高于BB和AB型（P＜0.05）。携带等位基因B个体失水率均较低，其中6岁牦牛携带等位基因B个体失水率显著低于未携带个体（P＜0.05），表明等位基因B能增加牦牛宰后肌肉保水性。CAPN1基因第1内含子突变对甘南牦牛熟肉率和酮体质量无显著影响。

3 讨论

甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛CAPN1基因第1内含子区发现 g.100+606G＞T的SNPs，构成AA、BB和AB基因型，3类群牦牛多态性信息含量为中度多态。田璐等［17］研究发现中国西门塔尔牛CAPN1基因存在CAPN1 316和CAPN1 4 751两个SNPs位点，多态性信息含量分别为0.07（低度多态）和0.37（中度多态）；吴孝杰等［18］在牦牛CAPN1基因第10 581 bp、5 837 bp发现两个SNPs位点，多态信息含量分别为0.332 3（中度多态）、0.152 0（低度多态）。本研究结果与以上研究均一致。

内含子虽然是基因中无编码功能的序列，但其对基因的表达调控有着重要作用［19］。在一些基因中内含子对基因表达具有正调控作用，Chang［20］发现猪MyHC基因内含子中存在重要的调控元件，可以调控转录起始来增强基因表达。在一些基因中内含子则表现为负调控作用，张静等［21］研究发现CART基因内含子中的NRSF序列参与介导了该基因的转录负调控作用。免疫球蛋白、IGF2、FSHβ、CPT-ivα、β-肌动蛋白和β角蛋白基因的内含子突变也引起基因表达效应发生变化［22］。因此，牦牛CAPN1基因内含子突变研究对了解与分析该基因遗传特征及其对性状影响仍然有重要意义。

甘南牦牛CAPN1基因第1内含子突变影响其肌肉嫩度，AA基因型个体肌肉嫩度剪切力值较低，其中3岁、5岁牦牛AA型个体嫩度剪切力显著低于BB或 AB型（P＜0.05）。Hoagland等［23］认为内源蛋白酶是引起肌肉嫩化的主要酶类，叶满红［24］报道钙蛋白酶参与了动物屠宰后肌肉蛋白水解，从而导致肌肉嫩化。钙蛋白酶家族中CAPN1和CAPN2都能水解肌原纤维，但人们普遍认为 CAPN1是参与肌肉嫩化的主要酶［25］。Morgan等［26］也报道CAPN1是动物宰后肌肉嫩化的主要酶。许多文献证实CAPN1基因突变影响牛肉嫩度，Page等［27-28］发现CAPN1基因两个错义突变与牛肉嫩度显著相关，并在Angus和Brahman杂交牛中证实上述两个突变对嫩度有累加作用。姜成国等［29］报道草原红牛、延边牛CAPN1基因第14内含子区突变影响肉质嫩度的相关检测指标（蒸煮损失、肌纤维直径、剪切力、滴水损失等），但与屠宰性状（净肉重、酮体质量、净肉率等）无关；Veiseth等［30］研究表明，CAPN1基因可以改善牛肉嫩度，同时对生产和胴体性状无负效应。因此，本研究发现的 CAPN1基因第1内含子突变可作为甘南牦牛肌肉嫩度性状选择的分子标记之一。

CAPN1基因第1内含子突变影响甘南牦牛肌肉失水率和眼肌面积，其中6岁甘南牦牛AA型个体失水率显著高于BB和AB型（P＜0.05），4岁、5岁牦牛AA型个体眼肌面积显著高于BB 或AB型（P＜0.05）。系水力指肌肉受外力作用时保持其原有水分的能力，牦牛屠宰后，pH值下降，肌肉蛋白质正负电荷间的平衡发生变化，蛋白质带净负电荷的数量减少，吸附水的能力下降。Chen等［31］研究显示，系水力越强，肉质越细嫩；姜昊［32］研究发现草原红牛CAPN1基因947位点突变对系水力有显著影响；吴孝杰［33］研究发现牦牛CAPN1基因第13内含子突变对失水率也有显著影响。在眼肌面积方面，韩瑞华［34］研究发现秦川牛及其杂种牛CAPN1基因第2外显子1 278位发生C→T的突变，MM型个体的宰前活重、酮体质量和眼肌面积显著高于MB个体；候冠彧［35］发现西门塔尔牛等9个群体中CAPN1基因MaeⅡ位点的多态与眼肌面积之间存在显著相关。本研究结果与以上研究结果也类似。

4 结论

甘南牦牛、天祝白牦牛和大通牦牛CAPN1基因第1内含子区检测到1处SNP，该突变影响不同年龄段甘南牦牛肌肉嫩度、失水率、眼肌面积等胴体及肉质性状，AA基因型个体肌肉嫩度剪切力值较低、眼肌面积较高而肌肉保水性较差，并在部分年龄段牦牛中达显著水平。该突变位点可作为甘南牦牛此类性状选择的遗传标记。

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（责任编辑 卢福庄）

Polymorphism in the intron 1 of CAPN1 and its association with carcass and meat quality traits in yak

CHEN Jie1，TIAN Zhi-li1，HU Jiang1，*，LUO Yu-zhu1，LIU Xiu1，WANG Ji-qin1，SHI Hong-mei2，LEI Jun-jie2
（1.College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University/Gangsu Key Laboratory of Herbivorous Animal Biotechnology，Lanzhou 730070，China；2.Institute of Animal Husbandry Science of Gannan Prefecture，Hezuo 747000，China）

The single nucleotide polymorphisms（SNPs）of CAPN1 gene in Gannan yak，Tianzhu yak and Datong yak were detected by the technology of PCR-SSCP.The relationship between SNPs and Gannan yak carcass and meat quality traits was analyzed.The results of PCR-SSCP indicated that there was a genetic mutation of g.100+606G＞T in the first introns of CAPN1 gene of all 3 groups to form 3 genotypes（AA，AB and BB）.Genetic analyses of CAPN1 gene showed that the polymorphism information contents in the detection region were 0.25＜PIC＜0.50，which belonged to a moderate polymorphism.Meat tenderness degree，water loss rate，eye muscle area of different age periods of Gannan yaks were regulated by genetic mutation of CAPN1.Lower shear force was observed in AA type yaks aged 3 and 5 years when compared with BB and AB type yaks（P＜0.05）.Higher eye muscle area was observed AA type yaks aged 4 and 5 years old when compared with BB and AB type yaks（P＜0.05）.Moreover，high-er water loss rate was observed in 6 years old AA type yaks when compared with BB and AB type yaks（P＜0.05）. Genetic mutation of g.100+606G＞T could be used as genetic markers.

Gannan yak；CAPN1 gene；polymorphism；carcass and meat quality traits

S823.8+5

A

1004-1524（2016）08-1315-08

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.08.07

2016-01-07

国家自然科学基金项目（31160451）；甘肃省杰出青年科学基金项目（1210RJDA008）；现代农业（肉牛牦牛）产业技术体系建设专项（CARS-38）

陈杰（1991—），男，福建福安人，硕士，主要从事动物遗传育种与生产研究。E-mail：269454336@qq.com
*

，胡江，E-mail：huj@gsau.edu.cn