张锋

（宝鸡文理学院 化学化工学院，陕西省植物化学重点实验室，陕西 宝鸡 721013）

油田化学

基于培养基优化和保护剂筛选的直投式酸奶发酵剂的研制*

张锋

（宝鸡文理学院 化学化工学院，陕西省植物化学重点实验室，陕西 宝鸡 721013）

利用正交试验确定了嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌培养基优化，冷冻保护剂筛选实验的最佳条件。添加1.0%番茄汁+0.3%玉米浆+2.0%乳糖的优化培养基具备良好生理特性，谷氨酸钠与脱脂乳对菌种活性在冷冻过程中有明显保护作用。在优化工艺下，冻干后活菌数分别达到4.3×1011cfu·g-1和4.2×1011cfu·g-1；冻干粉复配成直投式发酵剂后具有良好的发酵特性，完全符合发酵高粘度酸奶用直投式发酵剂的要求。

冻干粉；直投式发酵剂；酸奶发酵

发酵酸奶由于其具有丰富的营养价值和良好的保健功能，国内消费者对酸奶的认识逐步提高，其产销量亦呈迅猛增长之势。目前，我国发酵酸奶的生产过程中，一般采用继代式酸奶菌种和直投式酸奶发酵剂（Direct-to-vat cultures，简称DVS）。继代式酸奶菌种方便、价廉，使得大小生产厂家均可自行调制，极大地扩充了酸奶生产领域，但在酸奶生产的进一步集约化、规模化发展中，继代式酸奶菌种的多次活化和扩培的烦琐工艺越来越不能满足要求［1］。直投式酸奶发酵剂不需要经过活化、扩增而直接应用于生产，邮寄储藏方便、保质期长，接种量少，使得每批发酵产品质量稳定，也防止了菌种的退化和污染，大大提高了发酵酸奶制品工业的劳动生产率和产品质量。因此，近年来越来越多的酸奶生产公司选择直投式酸奶发酵剂用于生产［2］。

为了得到高活菌数并且具有良好发酵性能的发酵剂，本文从培养基优化、冷冻干燥保护剂筛选关键技术方面入手，研究了适合保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生长的培养基和培养时间，确定最佳的培养条件，并配制成具有良好发酵特性的直投式酸奶发酵剂。旨在生产出优质廉价、发酵特性与国外同类产品相近的直投式酸奶发酵剂，并优化其工业化生产工艺。

1　实验部分

1.1菌种

保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus GF，文中以 GF表示） 嗜热链球菌（Streptococcus. thermophilus BF，文中以BF表示）由宝鸡圣丰乳业有限责任公司鉴定并提供。

1.2pH值测定

采用PHS-3C型酸度计。

1.3酸度测定［3］

在无菌条件下取出10mL酸奶于50mL小烧杯中，加入20mL蒸馏水，混匀后在其中加入1～3D酚酞试剂，用0.100mol·L-1NaOH标准溶液滴定至样品呈粉红色且30s不退去，读出所用的NaOH的体积数，再乘以10，则此数值即为样品的滴定酸度，以吉尔涅度（oT）表示。

1.4生长曲线测定

为了得到GF和BF的生长规律，按2%的接种量将GF和BF分别接种到其发酵培养基中，在37℃培养，每隔一段时间取样测OD和pH值。以时间为横坐标，OD值为纵坐标作图，得出生长曲线。

1.5OD值测定

Cary-50型分光光度计在600nm波长下测定，当OD超过0.7时作稀释，控制稀释倍数，使测得的OD值在0.4～0.7范围内，实际测得的OD值乘以稀释倍数就是所得的OD值。

1.6菌落计数

BF和GF计数都采用倾注平板法计数，以MRS固体培养基，在37℃下厌氧恒温培养48～72h，使用Scan100菌落计数器计数。

1.7培养基优化

以MRS培养基［4］为基础，参考部分文献研究结果，选取番茄汁、玉米浆、乳糖作为促生长因子，设计正交试验因素，具体方案见表1，在最佳培养条件下进行培养，活菌计数。

表1　培养基优化实验方案Tab.1　Experiment scheme of medium optimization

1.8保护剂筛选

取离心后收集的菌体0.5mL沉淀并作活菌计数，作为对照，同时对加入不同保护剂的菌种并经过预冻和真空冷冻干燥的菌体测定活菌数，计算存活率，筛选最优保护剂。不同保护剂正交实验方案见表2。

表2　保护剂筛选实验方案Tab.2　Experiment scheme of protective agent screening

1.9酸奶发酵

11.5%全脂奶粉和6%的蔗糖，完全按酸奶生产工艺溶解均质灭菌后，接种，在43℃恒温发酵。

2　结果与讨论

2.1培养基优化实验

表3　GF/BF培养基成分优化正交实验结果Tab.3　Orthogonal experiment results of the GF/BF culture medium composition optimization

由表3得出，对菌落数目影响因素的大小顺序为番茄汁＞玉米浆＞乳糖。由活菌数结果结果可知，优化最佳培养基成分为番茄汁1.0%+玉米浆0.3%+乳糖2.0%。在最优培养基条件下，重复进行了两次验证试验，活菌计数平均为1.58×109cfu· mL-1，与表1数据相似。张兰威［5］等将脱脂乳分别与番茄汁和啤酒混合进行培养基优化，对菌落数增值起到了明显促进作用。啤酒中含有丰富的氨基酸、维生素等酵母代谢必需物，有利于GF和BF增殖。但随着啤酒含量超过5%，反而对细菌生长出现较为明显的抑制作用，这可能与酒精对细菌的作用有关。而单纯添加番茄汁则可能会影响培养基pH值，进而抑制BF增殖。刘丹［6］等则通过碳氮源及缓冲盐筛选提高了菌种培养效果。而报道的专利［7］和文献［8］则通过添加超滤浓缩乳或蛋白胨作为辅助营养成分来使菌落增值，菌数可达108cfu·mL-1，但不足之处在于培养基成本较高。而本研究的增殖培养基也能达到相同数量级的细菌增殖效果，相比较之下成本较低。

2.2保护剂筛选实验

表4　保护剂筛选正交实验结果Tab.4　Orthogonal experiment results of protective agent screening

由表4直观分析得出，对活菌冻干后存活影响因素谷氨酸钠＞脱脂乳＞海藻糖＞甘油＞吐温80。KILARA A等将麦芽提取液、炼乳、乳清用于菌种冷冻干燥的保护剂，均得到了较好的效果。GRACIELA等则将多元醇引入添加脱脂乳的保护体系，结果证明聚乙二醇、甘油、果胶等多羟基物质均能起到保护菌种活性的作用。这与该类物质物质与菌种蛋白形成氢键，从而保证其在冷冻过程中结构完整性有关。而谷氨酸钠、吐温80作为常规的冷冻干燥保护剂，在相关文献中均有涉及［9］。但是不同保护剂对菌株的保护作用，只有对其进行合理搭配才能起到最佳保护效果。如表4数据所示，上述保护剂之间存在一定程度相互抑制作用，同时添加不利于达到最佳保护效果，按照影响因素大小优先考虑谷氨酸钠与脱脂乳作为冷冻保护剂。

2.3最佳生长曲线

将经过活化的GF和BF，按2%的接种量接入优化培养基中，在37℃下培养，每隔一定时间取样分别测定发酵液OD值、pH值，得到GF和BF的生长曲线。

图1　GF和BF生长时的OD变化情况Fig.1　OD changes in GF and BF growth

从图1可以看出，GF和BF的发酵曲线十分相似。在0～4h时两株菌的OD都没多大变化，菌体生长处与延滞期。4～12hOD值迅速上升处在菌体生长的对数生长期，12h后OD增加趋缓，进入菌体生长的稳定期。

图2　GF和BF生长时pH值变化情况Fig.2　pH changes in GF and BF growth

从图2也可以看出这一趋势。一般来说，对数生长期后期和稳定期前期的菌种保存活力最高［10］。所以我们选择12、14h作为菌体培养的收获期，作冻干试验。根据前期试验，我们选用已经成熟的菌体收集工艺、冻干保护剂配方和冻干工艺。两株菌在培养12、14h后分别离心收集菌体，添加保护剂，冻干，测定活菌数得到表5的数据。

表5　GF和BF在培养12、14h后收集后的冻干情况（1000mL发酵液）Tab.5　Freeze dry conditions of GF and BF collection after 12 and 14h culture（1000mL fermentation broth）

从表5可以看出，在不同收获点两株菌的菌粉得率和活菌数都有较大差异，GF在培养12和14h后收获的菌粉分别达到1.12和2.19g·L-1，得率差距比较大，但活菌数没有数量级上的差别。BF在培养12、14h后收获的菌粉分别达到4.99和4.85g·L-1，菌粉得率差别不大，而且活菌数差别也不大。

将所得到的GF和BF菌粉添加保护剂后复配制成直投式发酵剂，发酵牛奶，3.5h时已经全部凝乳，4h时终止发酵，测定酸度，放入6℃冰箱后酵。结果见表6

表6　不同时间段收获得到的冻干粉配制的发酵剂的发酵性能Tab.6　Fermentation capability of Leavening agents prepared by freeze dried powder obtained at different time periods

从表6可以看出，14h收获的菌体制成发酵剂后的性能明显优于12h收获的菌体制成的发酵剂。而同一时间段收获的菌体制成的发酵剂，在菌种比例不同时发酵性能也不相同。我们选择14h收获的菌体来制成菌粉，按活菌数1∶1比例再添加适量保护剂后配制成发酵剂。

按上述工艺500L发酵罐发酵生产菌粉，将菌粉复配（暂命名为FJJ）后发酵酸奶，以目前市场上两家公司的两款主流发酵剂做对比，结果见图3。

图3　复配后发酵剂的发酵曲线Fig.3　Fermentation curve of compound fermentation agent

从图3可以看出，当发酵到3h时，FJJ与对照2酸度几乎相同，高于对照1。而当发酵到4h时，对照1酸度65.970T，对照2酸度74.170T，FJJ的酸度为69.580T，基本达到生产要求。发酵从4h培养到6h时，对照1和对照2酸度增长明显，而FJJ酸度增长开始变慢，这从侧面说明该发酵剂后酸化情况十分理想。但是GF在离心过程中不易分离收集，菌体浪费现象严重，为了进一步降低成本需要改进培养和分离工艺。发酵剂成品在稳定性加速试验中表现优秀，但还需稳定性长期试验验证。

3　结论

添加1.0%番茄汁+0.3%玉米浆+2.0%乳糖的优化培养基具有良好的生理特性，能够促进GF和BF菌株生长，是最佳增殖培养基，活菌计数平均为1.58×109cfu·mL-1。冷冻干燥保护剂保护效果谷氨酸钠＞脱脂乳＞海藻糖＞甘油＞吐温80，优先考虑谷氨酸钠、脱脂乳作为冷冻保护剂。

在上述优化条件下GF和BF菌体在冻干后均达到1011cfu·mL-1以上，且培养14h时收获的菌体，在制成直投式发酵剂后具有良好的发酵特性及后酸化水平，制备得到的酸奶与市售酸奶口感风味较为接近，完全符合直投式发酵剂的要求，可以满足酸奶制造商的需要，具备开发成酸奶发酵剂的前提。

［1］ 高松柏，黄少磊.双歧杆菌和双歧杆菌菌粉的研究［J］.中国乳品工业，1991，19（2）：51-61.

［2］ 吕兵，张国农，肖光辉.新型酸奶发酵剂的研究［J］.中国乳品工业，1999，27（5）：9-16.

［3］ 周雪峰.双歧杆菌与酸奶菌的混合发酵中菌种配比的研究［J］.淮海工学院学报，2001，10（4）.

［4］ ISO 7889-2003 Yogurt-Enumeration of characteristic microorganisms-Colony-count technique at 37℃.

［5］ 张兰威，刘维，张书军.促进混合培养的保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌生产物质的研究［J］.中国乳品工业，1999，27（3）：12-15.

［6］ 刘丹，潘道东.直投式乳酸菌发酵剂增菌培养基的优化［J］.食品科学，2005，26（9）：204-207.

［7］ 吴荣荣，张柏林.直投式酸奶发酵剂的发酵工艺及其优化［J］.食品科学，2006，27（2）：178-181.

［8］ 张建友，李艳武，赵群波，等.冻干乳酸菌菌种增菌培养基的优化［J］.中国乳品工业，2002，30（5）：14-17.

［9］ 吕燕妮，靳志强，李平兰，等.酸奶生产用直投式乳酸菌发酵剂研究［J］.乳品加工，2005，11（2）：47-50.

［10］ 凌代文.乳酸菌细菌分类鉴定及实验方法［M］北京：中国轻工业出版社，1999.111-112.

Study on the direct-to-vat culture based on culture medium optimization and protective agent screening*

ZHANG Feng
（Dept.of Chemistry and Chemical Engineering，Baoji University of Arts and Science，Shaanxi Key Laboratory of Phytochemistry，Baoji 721013，China）

In this paper，the optimization experiment condition of culture medium optimizing and cryoprotectants screening was determined for Streptococcus.thermophilus and Lactobacillus bulgaricus by orthogonal experiment.and the best of the.Optimized medium has good physical properties with adding mixture of 1.0%tomato juice，0.3%corn pulp and 2.0%lactose.Sodium glutamate and skimmed milk have obvious protective effects on bacterial activity in the freezing process.In the optimization process，their viable count can separately reach 4.3×1011cfu·g-1and 4.2×1011cfu·g-1in the freeze-dried microbial powder.The Direct-to-vat cultures，consistted of both freezedried microbial powder，had good characteristics in compliance with the high viscosity yogurt fermentation.

Freeze-drying microbial powder；direct-to-vat cultures；yogurt fermentation

TS252.4

A

10.16247/j.cnki.23-1171/tq.20160718

2016-04-26

陕西省科技厅工业攻关项目（2014K08-36）；宝鸡市科技局项目（2013R7-4）；陕西省植物化学重点实验室项目（14JS0 05、12JS008）；宝鸡文理学院重点项目（ZK12033）

张锋（1982-），男，硕士，讲师，2010年毕业于华东理工大学生物化学专业，主要从事生物催化研究。