郁有祝，王艳飞，郭玉华

(安阳工学院 化学与环境工程学院，河南 安阳 455000)

0 引言

香豆素类化合物具有明显的生物学活性，例如抗菌[1]、抗HIV[2]、抗肿瘤[3]、抗氧化[4]等.血清白蛋白是生物体内重要的载体蛋白，可以和许多内源性、外源性分子结合[5]，许多药物小分子被吸收后往往是通过血清白蛋白储存、运转，从而发挥作用的.金属离子广泛存在于生物体中并参与生命活动，其中包括人体必需的微量元素如铁、铜、锌等，这些金属离子既可与香豆素类化合物结合，也可与人血清白蛋白结合，从而对两者的相互作用产生影响.因此，研究金属离子对药物分子与血清白蛋白相互作用的影响，能够更确切地了解体内药物分子与蛋白的作用.

香豆素-3-羧酸与牛血清白蛋白的相互作用已有报道[6]，但尚未见Cu2+、Fe3+、 Zn2+对两者相互作用影响的报道.本实验利用荧光光谱法研究Cu2+、Fe3+、Zn2+对香豆素-3-羧酸与牛血清白蛋白相互作用的影响，为探讨金属离子对香豆素类药物在体内的运转、代谢及药效等影响提供参考.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

日立F-7000荧光分光光度计，日立高新技术公司；T6-新世纪紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司.

牛血清白蛋白(BSA，Roche公司)用pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液(内含0.05 mol/LNaCl)配制成1.0×10-4mol/L储备液；香豆素3-羧酸(实验室合成)，配成浓度为1.0×10-3mol/L溶液；CuCl2、Fe(NO3)3、Zn(NO3)2用水配成1.0×10-3mol/L溶液.

1.2 实验方法

在10 mL比色管中依次加入0.5 mL 10-5mol/L BSA溶液、0.5 mL 1.0×10-3mol/LCu2+或Fe3+或Zn2+溶液、1.0 mL Tris-HCl(pH=7.4)缓冲溶液及不同体积1.0×10-3mol/L香豆素-3-羧酸溶液，定容，放置30 min，以280 nm为激发波长，扫描荧光光谱.

2 结果与讨论

2.1 Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下香豆素-3-羧酸与BSA作用的荧光光谱

Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下不同浓度香豆素-3-羧酸对BSA的荧光猝灭光谱如图1所示，不同浓度香豆素-3-羧酸对BSA的荧光猝灭光谱作为对照.由图1可见， Cu2+、Fe3+、Zn2+的加入，使得香豆素-3-羧酸对BSA的荧光猝灭加强，BSA的峰形变化不大，荧光发射峰的位置没有显著移动.

CBSA=0.5×10-6mol·L-1，C(Cu2+)=C(Fe3+)=C(Zn2+)=0.5×10-4mol·L-1, C香豆素-3-羧酸(1-8)：0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 /10-5mol·L-1图1 金属离子存在下香豆素-3-羧酸对 BSA的荧光猝灭光谱Fig. 1 Fluorescence spectra of coumarin-3-carboxylic acid-BSA system in presence of metal ions

离子T/KStern-Volmer方程RKq/(1012×L·mol-1·s-1)空白298y = 0.78×104x + 1.040.9930.78310y = 0.67×104x + 1.020.9950.67Cu2+298y = 5.24×104x + 0.930.9955.24310y = 4.97×104x + 0.960.9964.97Fe3+298y = 7.42×104x + 0.950.9957.42310y = 7.28×104x + 0.940.9957.28Zn2+298y = 4.80×104x + 1.010.9984.80310y = 4.64×104x + 0.900.9934.64

2.2 Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下香豆素-3-羧酸对BSA的荧光猝灭类型

为了进一步确定荧光猝灭类型，根据Stern-Volmer方程[7]F0/F=1+Ksv[Q]=1+Kqτ0[Q] (式中：F0和F分别为猝灭剂不存在和存在时体系的荧光强度；[Q]为猝灭剂的浓度)，做了25 ℃、37 ℃时Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下，香豆素-3-羧酸对BSA的Stern-Volmer曲线，求得荧光猝灭常数Ksv，生物大分子的平均荧光寿命τ0为1×10-8s，而Ksv=Kqτ0，由此可计算出猝灭过程的猝灭速率常数Kq，列于表1中.

由表1可知，有无金属离子，荧光猝灭速率常数Kq均随温度升高而减小，说明Cu2+、Fe3+、Zn2+的加入没有改变荧光猝灭类型，香豆素-3-羧酸对BSA的荧光猝灭类型为静态猝灭[8].在298 K金属离子存在时的Kq均大于无金属离子时的Kq，表明金属离子的存在均增强了香豆素-3-羧酸对BSA的荧光猝灭，且Fe3+的影响最大.

2.3 Cu2+、Fe3+、Zn2+对香豆素-3-羧酸与BSA作用的影响

为进一步探讨Cu2+、Fe3+、Zn2+对香豆素-3-羧酸与BSA作用的影响，根据公式[9]：lg[(F0/F)-1]=lgKA+nlg[Q]求得不同温度时，Cu2+、Fe3+、Zn2存在下香豆素-3-羧酸与BSA的结合常数KA、结合位点数n，结果如表2所示.

表2 金属离子存在下香豆素-3-羧酸与BSA的结合常数及结合位点数

结果表明，在298 K及310 K下，Cu2+、Fe3+、Zn2+存在时香豆素-3-羧酸与BSA的结合常数均有明显增大，表明Cu2+、Fe3+、Zn2+加强了香豆素-3-羧酸与BSA的作用，延长了药物在血浆中的贮留时间，有助于药物持久缓释发挥药效.由表2还可以看出，金属离子的存在影响香豆素-3-羧酸与BSA的结合常数，但结合位点数n都近似等于1，说明Cu2+、Fe3+、Zn2+参与了香豆素-3-羧酸与BSA的结合，香豆素-3-羧酸与BSA只在一个位点发生作用.

2.4 Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下香豆素-3-羧酸与BSA作用的热力学参数及作用力类型

有机小分子与蛋白质等大分子之间的作用力主要有氢键、静电作用力、疏水作用和范德华力等.而作用过程中的热力学参数是判断作用力类型的主要标准.当温度变化范围不大时，作用过程的ΔH可看做一定值.根据热力学方程ln(K2/K1)=ΔH(1/T1-1/T2)/R和ΔG=-RTlnK=ΔH-TΔS可计算出Cu2+、Fe3+、Zn2+存在下香豆素-3-羧酸与BSA作用的热力学参数结果如表3所示.

表3 金属离子存在下香豆素-3-羧酸与BSA作用的热力学参数Tab. 3 Thermodynamic parameters of coumarin-3-carboxylic acid-BSA system in presence of metal ions

根据反应前后热力学焓变ΔH和熵变ΔS的相对大小，可判断药物小分子与蛋白质之间的主要作用力类型[10]，即ΔH>0，ΔS>0时，属于疏水作用；ΔH<0，ΔS<0，属于氢键和范德华力；ΔH<0，ΔS>0时主要属于静电引力.表3中ΔG<0表明有无金属离子存在香豆素-3-羧酸与BSA的作用过程均是自发过程.不存在金属离子时，香豆素-3-羧酸与BSA间的作用力主要是疏水作用力，Fe3+和Cu2+存在下，作用力类型改变为静电引力；Zn2+存在下，香豆素-3-羧酸与BSA间的作用力类型没有发生变化，仍是疏水作用力，但热力学参数值发生了变化，这进一步说明Cu2+、Fe3+、Zn2+参与了香豆素-3-羧酸与BSA的结合作用.

2.5 Cu2+、Fe3+、Zn2+对香豆素-3-羧酸紫外光谱的影响

以pH=7.4 Tris-HCl缓冲溶液为参比，分别做出香豆素-3-羧酸与Cu2+、Fe3+、Zn2+作用的紫外吸收光谱见图2.由图可知向香豆素-3-羧酸中加入不同浓度Cu2+、Fe3+、Zn2+后，其吸收曲线形状几乎没变，最大吸收峰强度均增大，可能是香豆素-3-羧酸与金属离子由于静电力作用络合而引起吸光度发生变化[11].结合2.3及2.4可以推断金属离子与香豆素-3-羧酸及BSA之间可能形成了三元配合物，增强了BSA与香豆素-3-羧酸的结合作用，使结合常数增大[12].

C香豆素-3-羧酸 =5×10-5mol·L-1，C(Cu2+) =C(Zn2+)(1-8)依次为(0,1,2,3,4,5,6,7)×10-5mol·L-1C(Fe3+) (1-7)依次为(0,1,2,3,4,6,7) ×10-5mol·L-1

3 结论

实验表明，一定浓度的Cu2+、Fe3+、Zn2+存在对香豆素-3-羧酸对BSA的荧光有协同猝灭作用，增大了香豆素-3-羧酸与BSA的结合常数，不同的金属离子对体系影响不同，Fe3+和Cu2+的存在改变了香豆素-3-羧酸与BSA间的作用力类型.由此可知，Cu2+、Fe3+、Zn2+对香豆素-3-羧酸与BSA的作用有较大影响，血液中Cu2+、Zn2+、Fe3+在一定浓度下有助于药效的发挥，为研究香豆素类药物的药理作用提供重要的信息.