汪元符（南昌市食品药品检验所，江西南昌330038）

GPC-UPLC-MS/MS测定湿润烧伤膏中罂粟壳化学成分

汪元符（南昌市食品药品检验所，江西南昌330038）

目的：针对中药制剂湿润烧伤膏，建立其中罂粟壳所含罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因等5种化学成分的凝胶渗透色谱-超高效液相色谱-质谱/质谱联用的检测方法。方法：色谱柱为Phenomenex Kinetex HILIC 100A（100 mm×2.1 mm，1.7μm）；柱温为40℃；流动相为10 mmol/L甲酸铵（以甲酸调节pH值至3.0）及乙腈，梯度洗脱；流速为0.2 m L/m in，以优化后的质谱参数采集信号。结果：各成分检出限浓度为0.1～0.5 ng/m L；定量限浓度为0.5～1.0 ng/m L；线性范围为各成分定量限～100 ng/m L；在线性范围内相关系数均在0.99以上；平均加样回收率86.5%～99.6%。结论：本方法准确，灵敏度高，专属性好；能用于湿润烧伤膏中罂粟壳化学成分的检测。

凝胶渗透色谱-超高效液相色谱-质谱/质谱；湿润烧伤膏；罂粟壳；化学成分

湿润烧伤膏是疗效显著，家庭常备的中药制剂。根据其质量标准［1］，是由黄连、黄柏、黄芩、地龙、罂粟壳制成。标准［1］收载了黄连、黄柏中盐酸小檗碱及黄芩中黄芩素的含量测定。在2015年版《中国药典》［2］中药饮片罂粟壳项下，收载了吗啡的含量测定。由文献［3-4］，罂粟壳有5种生物碱化学成分（罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因）可建立含量测定，其中罂粟碱、吗啡、可待因是最重要的3种。作为一种方法补充，本实验室建立了凝胶渗透色谱-超高效液相色谱-质谱/质谱联用法（GPC-UPLC-MS/MS），用于检测湿润烧伤膏中组药罂粟壳所含的罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因等5种化学成分。

1　仪器、试剂与材料

磐合Freestyle SPE/EVA凝胶渗透色谱仪，AB Sciex 4000 Qtrap质谱，ekspert ultraLC100超高效液相色谱仪，METTLER TOLEDO ME204E电子分析天平，METTLER TOLEDO XS105电子分析天平，Hettich Rotina 380R 1706型医用低速离心机，昆山KQ-300DB型数控超声波清洗器，亚荣RE-52A旋转蒸发器，ANPEL DC-24氮吹仪，M illipore超纯水系统。

甲醇（色谱纯，Merck）、乙腈（色谱纯，Merck），乙酸乙酯（色谱纯，Merck），环己烷（色谱纯，Merck），甲酸（色谱纯，天津科密欧），甲酸铵（色谱纯，武汉伟琪博星）。

对照品：盐酸罂粟碱（批号：171214-201205）、吗啡（批号：1712101-201123）、那可丁（批号：171224-200403）、磷酸可待因（批号：171203-201306）、蒂巴因（批号：171216-201304），均为中国食品药品检定研究院提供。

样品：购自流通或医疗机构。规格：40 g，共6个批次：20140501，20140610，20140802，20141020，20150122，20150310，对应编号为①～⑥。

2　方法与结果

2.1　高效液相色谱分析条件

分析柱：Phenomenex Kinetex HILIC 100A （100 mm×2.1 mm，1.7μm）。柱温：40℃。流速：0.2m L/min。进样量：5μL。流动相：A为10mmol/L甲酸铵以甲酸调节pH值至3.0，B为乙腈。按表1进行梯度洗脱。

2.2　质谱分析条件

电喷雾离子源（ESI）：正离子模式（ESI+）。扫描模式：多重反应监测。扫描范围：50～600 Da。气帘气压力：25 Pa。碰撞气密度：中。电离喷雾电压：5 500 V。离子源温度：500℃。雾化气压力：55 Pa。辅助气压力：50 Pa。界面加热状态：开。离子对选择见表2。

表1　梯度洗脱程序

表2　质谱分析

2.3　对照品溶液的配制

取盐酸罂粟碱、吗啡、那可丁、磷酸可待因、蒂巴因对照品各约10 mg，精密称定，以甲醇制成每1 m L中各含罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因1 mg的溶液作为对照品储备液。精密量取对照品储备溶液1 m L，以甲醇制成各含1 000 ng/m L 和100 ng/m L的溶液，作为对照品使用液。

标准系列工作液的配制：以25 m L量瓶制备，分别精密量取浓度为100 ng/m L和1 000 ng/m L的混合标准品使用溶液适量，以甲醇定容至25m L，制成各含罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，10.0，20.0，30.0，40.0，50.0，100.0 ng/m L的标准系列工作液。

2.4　供试品溶液的配制

将6批样品分别混匀，各取10 g，精密称定，置具塞烧瓶中，加入甲醇约100 m L，超声处理（功率250 W，频率35 kHz）30 m in，放冷至室温，以10 000 r/m in离心15 m in后，取上清液置鸡心瓶中，40℃旋蒸至近干，以10 m L乙酸乙酯-环己烷（1∶1）复溶，以0.2μm微孔滤膜过滤后，取续滤液上凝胶渗透色谱净化处理。

凝胶渗透色谱净化参数：净化柱（400 mm× 25mm），采用BIO-Beads S-X3填料，200～400目，检测波长254nm，流动相乙酸乙酯-环己烷（1∶1），流速5m L/min，进样量5 m L，开始收集时间15 m in，结束收集时间40 m in，定量浓缩至1.0 m L。

取浓缩好的净化样，氮气吹干，以1.0 m L甲醇复溶，经0.2μm微孔滤膜过滤后，取续滤液测定。

2.5　对照品浓度为5 ng/m L时各离子对提取质谱图

见图1至图10。

1　罂粟碱定量离子对（340.7/202.1）提取质谱图

2　罂粟碱定性离子对（340.7/171.0）提取质谱图

3　吗啡定量离子对（286.3/165.0）提取质谱图

4　吗啡定性离子对（286.3/181.2）提取质谱图

5　那可丁定量离子对（414.8/220.0）提取质谱图

6　那可丁定性离子对（414.8/353.3）提取质谱图

7　可待因定量离子对（299.8/215.1）提取质谱图

8　可待因定性离子对（299.8/165.0）提取质谱图

9　蒂巴因定量离子对（312.5/58.0）提取质谱图

10　蒂巴因定性离子对（312.5/249.0）提取质谱图

2.6　定性确认

采用保留时间与对照品相一致，且定性与定量离子对相对离子丰度比应满足表3要求，判为检出。

表3　定性时相对离子丰度的最大允许偏差（%）

各对照品试验结果见表4。

2.7　线性关系及检出限、定量限考察

采用“2.1”项下的色谱条件，“2.2”项下的质谱条件，以“2.3”项下的标准系列溶液进样检测。以检测所得峰面积为纵坐标，以标准系列溶液浓度（ng/m L）为横坐标，进行线性拟合。以定性离子对和定量离子对提取的质谱图信噪比均大于3时的浓度（ng/m L）为检出限。以定性离子对提取的质谱图信噪比大于3，定量离子对提取的质谱图信噪比大于10时的浓度（ng/m L）为定量限。以在一定浓度范围内，相关系数大于0.99，为线性范围。结果见表5。

表4　对照品试验结果

2.8　精密度试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为10.0 ng/m L的标准溶液，连续进样6针，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表6。

表5　线性关系及检出限、定量限考察结果

表6　精密度试验结果

2.9　稳定性试验

选用标准系列溶液中各成分浓度为10.0 ng/m L的标准溶液，在0，1，2，4，8，12，24 h分别进样，以提取的定量离子对质谱图峰面积计算。结果见表7。

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表7　稳定性试验结果

2.10　回收率试验

自制罂粟壳阴性空白样品。以黄连、黄柏、黄芩、地龙等比混合，打成细粉，再与麻油适当混匀，按“2.4”项制备空白供试品溶液，再按“2.1”及“2.2”项下的条件检测，确证罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因等5种化学成分均为阴性。以此为阴性空白样，平行取9份，分别为10 g，各精密加入标准系列工作液中浓度为5，50，100 ng/m L标准液，加入量为2 m L，然后按“2.4”项下其余步骤制备样液，则最终得加标样液浓度理论值应为5，50，100 ng/m L，以此计算回收率，结果见表8。

表8　加标回收试验结果

结果各化学组分高、中、低三个浓度的回收率均在86.5%～99.6%之间。

2.11　样品测定结果

检测了6批次样品，结果见表9。

3　讨论

3.1　凝胶渗透色谱收集时间的选择

因样品为油性基质，对含量测定干扰较大，故采用GPC净化。经采集不同收集时间段的样液进行检测，在15 m in之前及40 min之后未检出目标化合物，因此在15 m in至40 m in之间为有效收集时间。

表9　 6批样品检测结果（μg/g）

3.2　液相色谱条件的选择

罂粟壳所含罂粟碱、吗啡、那可丁、可待因、蒂巴因等5种化学成分极性较强，试用C18柱，样品在0.5 m in内出峰，几无保留，所以采用亲水柱。

采用甲酸铵盐缓冲液-乙腈系统，离子化效率高，离子强度大，检测灵敏度高。为提高检测限，改善峰形，采用梯度洗脱的方式。比较了不同pH值的流动相，结果在pH值为3.0时各成分分离较好。

3.3　质谱条件的优化

选用灵敏度最高的一组离子对作为定量离子对，再选择灵敏度次高的一组离子对作为定性离子对。

［1］国家食品药品监督管理局.国家药品标准（新药转正标准）第40册.湿润烧伤膏［S］.WS3-043（Z-005）-2002（Z），2002.

［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典［M］.北京：中国医药科技出版社，2015：369-370.

［3］李雕，李进瞳，曾燕，等.不同等级罂粟壳有效成分含量的研究［J］.中国中药杂志，2010，35（17）：32-35.

［4］徐丽红，王建清，陶秋，等.高效液相色谱同时测定3类食品中的5种罂粟壳生物碱［J］.分析测试学报，2011，30（12）：65-69.

［5］张林田，黄少玉，陆奕娜，等.固相萃取/HPLC-MS/MS检测食品中吗啡等五种罂粟壳生物碱残留［J］.分析试验室，2014，33 （6）：108-111.

［6］祝伟霞，杨冀州，刘亚风，等.四极杆-轨道阱高分辨质谱联用技术用于食品中罂粟壳特征成分的确证［J］.分析测试学报，2015，34（5）：7-13.

Determ ination of Chem ical Com ponents of Papaveris Pericarpium in MEBO by GPC-UPLC-MS/MS

Wang Yuanfu（Nanchang Institute for Food and Drug Control，Jiangxi Nanchang 330038，China）

Objective：To develop a GPC-UPLC-MS/MS method for determ ination of five chem ical components （papaverine，morphine，narcotine，codeine and thebaine）of papaveris pericarpium in MEBO.M ethods：Phenomenex Kinetex HILIC 100A column（100 mm×2.1 mm，1.7μm）was adopted.The column temperature was 40℃.The mobile phase was 10 mmol/L ammonium formate（pH 3.0）-acetonitrile，which was used for gradient elution at a flow rate of 0.2 m L/min.The signals were collected by using the optimized parameters.Results：The detection lim it of this method was 0.1～0.5 ng/m L，while the lim it of quantitation was 0.5～1.0 ng/m L，and the linear range was the lim it of quantitation～100 ng/m L.The correlation coefficients w ithin the linear range were more than 0.99.The average recoveries of test samples were 86.5%～99.6%.Conclusion：This method shows high accuracy，sensitivity and specificity，which may be used for the determination of five chemical components of papaveris pericarpium in MEBO.

GPC-UPLC-MS/MS；MEBO；Papaveris Pericarpium；Chemical Component

10.3969/j.issn.1672-5433.2016.07.003

汪元符，男，主管药师。研究方向：中药理论、药物检测及食品安全。E-mail：wanngel@126.com

2016-03-10）