张乐 韩娟 范震★

ERCP治疗ABP细胞因子及小肠黏膜COX-2蛋白研究

张乐 韩娟 范震★

目的 探讨经内镜逆行性胰胆管造影术（ERCP）介入治疗对急性胆源性胰腺炎（ABP）患者血清细胞因子及小肠黏膜环氧化酶-2（COX-2）蛋白表达的影响作用及其相关性。方法 根据有无器官功能障碍或局部并发症、Ranson评分＜或≥3分、CT 分级分为轻症急性胰腺炎（MAP）和重症急性胰腺炎（SAP）两组。分别提取两组ERCP术前及术后1周患者血液及小肠黏膜组织，应用酶联免疫吸附测定法（ELISA）及免疫组化技术分别检测血清细胞因子IL-6及十二指肠黏膜COX-2蛋白表达。结果 30例ABP患者，经ERCP内镜治疗后，术后1周较术前生化指标明显改善（P＜0.01）；两组30例ABP患者，血清IL-6表达SAP组明显高于MAP组（P＜0.01），经ERCP内镜治疗术后1周较术前患者血清IL-6表达明显降低 （P＜0.05） ；两组30例ABP患者，术前十二指肠黏膜COX-2蛋白表达SAP组明显高于MAP组（P＜0.05），经ERCP内镜治疗术后1周较术前COX-2蛋白表达明显降低（P＜0.05）。结论 ABP患者经ERCP介入治疗后临床表现及生化指标明显改善。ABP患者重症者较轻症者血清IL-6及小肠黏膜COX-2蛋白高表达，经ERCP介入治疗术后血清IL-6及小肠黏膜COX-2蛋白表达降低。

ERCP 急性胆源性胰腺炎 白介素-6 环氧化酶-2

经内镜逆行性胰胆管造影术（ERCP）已成为急性胆源性胰腺炎（ABP）的一种重要治疗手段。在AP发病中所起的作用中，“细胞因子学说”已占有重要地位。其中血清IL-6在短期内可达峰值，其高峰出现时间和浓度可作为早期识别AP病情轻重的有效指标。另有报道认为，在AP的进展和严重程度方面COX-2是一个关键的早期炎症介质和早期反应基因模式。 COX-2作用于胰腺的可能机制为：促进胰酶的分泌；影响胰腺血流和诱发胰腺微循环障碍；促进胰腺血管内皮炎症；水解生物膜，破坏线粒体和溶酶体。

1　 临床资料

1.1 一般资料 2014年12月至2015年2月期间确诊ABP的住院患者30例，男14例，女16例，年龄38～85岁，平均（62.0±15.0）岁。合并高血压病10例、糖尿病11例、 冠心病6例。

1.2 ABP患者临床分型及评判标准 临床胰腺分型可分为轻症胰腺炎和重症胰腺炎，通过Ranson积分［1］和影像学上的CT分级来综合评判予以分型。Ranson积分＞3分即为重症急性胰腺炎。CT分级∶A～C级：临床上为轻症急性胰腺炎；D～E级：为重症急性胰腺炎。综合上述评判标准，30例ABP患者分为轻症急性胰腺炎（MAP）22例，重症急性胰腺炎（SAP）8例。

2　 结果

2.1 ERCP内镜治疗及疗效 30例ABP患者经内镜插管行ERCP治疗均成功，成功率100%（30/30），常规留置鼻胆管引流（ERCP+EST+ENBD），其中行EPBD 者5例。ERCP术后2例（40%）患者并发术后一过性高淀粉酶血症，3例（10%）患者术后腹痛加重，考虑EST所致，术后无出血、穿孔及死亡患者。ERCP术后1周与术前比较患者腹痛、黄疸及肝功能明显改善（P＜0.01）；ERCP术后1周血清淀粉酶较ERCP术前水平明显降低（P=0.001）。见表1。

表1 ERCP治疗前后肝功能指标［n=30，（±s）］

表1 ERCP治疗前后肝功能指标［n=30，（±s）］

ALT（U/L）　AST（U/L）　GGT（U/L）　B-AMS（U/L）　GLU（mmol/L）　TBIL（μmol/L）　DBIL（μmol/L）术前　204.6±151.57　114.43±104.79　295.64±198.27　302.30±102.30　9.49±4.71　160.70±100.4　114.25±91.30术后　76.50±62.0　40.14±26.78　156.50±116.62　20.41±11.32　5.01±2.61　98.27±92.40　67.23±58.17 P值　0.000　0.002　0.001　0.001　0.000　0.014　0.015

2.2 ABP患者ERCP介入治疗前后血清IL-6表达 30例ABP患者重症组血清IL-6表达明显高于轻症组，差异有统计学意义 （P＜0.05），30例ABP患者两组经ERCP治疗术后1周较术前血清IL-6表达均明显降低，差异有显著统计学意义（P＜0.01）。见表2。

表2 ERCP治疗前后两组患者血清IL-6浓度变化比较（pg/ml）

2.3 ABP患者ERCP介入治疗前后小肠黏膜COX-2表达及内镜下观察 30例ABP患者重症组小肠黏膜COX-2表达阳性率明显高于轻症组，差异有统计学意义 （P＜0.05），两组经ERCP治疗术后1周较术前明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。30例ABP患者内镜下小肠黏膜明显充血水肿，伴有不同程度的糜烂和溃疡 见表3。

表3 ERCP治疗前后两组患者COX-2表达阳性率［n（%）］

3　 讨论

3.1 胆源性胰腺炎内镜介入治疗 目前，关于ABP的治疗策略主要有三种：内科保守治疗、外科手术治疗及内镜介入治疗［2］。多项研究表明ABP早期不适宜外科手术，因手术创伤大，感染率高，脏器应激性损伤大。因此内科保守治疗及内镜治疗成为临床上的主要选择。一些专家［3］认为，内科经积极解痉与抗感染治疗，能够有效缓解胆管壁黏膜的水肿情况，小结石会排入十二指肠，大结石则会浮起，胆道梗阻可能解除。对于ABP，无论是梗阻型还是非梗阻型，均应先行非手术治疗，先缓解症状，为手术创造有利条件，主张延期手术。另一些专家主张早期内镜介入治疗，通过ERCP+EST+ENBD等取石的方法，可以从根本上去除病因，解除或降低胆道、胰管内压力、通畅胰液引流，避免胰腺炎轻症型向重症型发展，且ERCP内镜介入治疗具有创伤小、对机体内环境影响较小，手术时间短等优点，避免外科手术可能导致的并发症，降低手术风险 。

研究［4］表明，与传统治疗方案比较，内镜早期联合内科治疗对ABP患者的主观症状、体征、生化指标、内毒素血症、TNF-α、IL-10、CD4+/CD8+、CT分级改善明显，患者住院费用、住院时间均明显减少，是安全、有效、经济的治疗方案。本资料显示，30例ABP患者通过ERCP内镜结合常规内科治疗后，腹痛、黄疸等主观症状、体征、生化指标明显改善（P＜0.01）。30例ABP患者ERCP术后未出现出血、穿孔及死亡。其机制可能为内镜治疗后胆胰管压力降低，改善胰腺微循环，阻断细胞因子及炎症介质的释放，从而减轻全身炎症反应进程，减少氧自由基、CO的产生，减少细菌易位，对胰腺细胞起保护作用所致。因此，内镜治疗对ABP有重要的临床价值。

3.2 血清IL-6的表达和临床意义 IL-6主要由单核细胞在肿瘤坏死因子（TNF）等诱导下产生，也可由激活的巨噬细胞、内皮细胞、成纤维细胞等产生，是一种重要的炎症始动因子。促炎-抗炎细胞因子学说认为［5，6］，机体受到有害的炎症刺激后炎症反应时，机体的保护机制被启动，释放促炎因子的同时抗炎机制也被启动，释放抗炎细胞因子对炎症反应进行调节。目前文献中提出的促炎细胞因子包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等，抗炎因子包括IL-4、IL-10、IL-12等。正常情况下，促炎细胞因子和抗炎细胞因子均呈低分泌状态，并保持平衡，当促炎细胞因子过度释放，而抗炎细胞因子处于相对劣势时，机体表现为全身炎症反应综合征（SIRS）。因此维持二者动态平衡在治疗SAP及防治MAP向SAP 进展中起重要的作用。本资料结果提示，30例ABP患者重症组血清IL-6表达明显高于轻症组（P＜0.05），经ERCP治疗术后1周较术前血清IL-6表达均明显降低 （P＜0.05），并与临床表现缓解及生化指标改善时间相符。提示血清IL-6表达与炎症程度密切相关。

3.3 小肠黏膜COX-2蛋白表达和临床意义 COX-2是前列腺素合成过程中一个主要的限速酶。研究发现，COX-2参与病理条件下的应激反应。COX作为产生PG合成的上游的限速酶，广泛参与细胞的生理、病理过程，特别在机体炎症发生过程中具有重要作用。COX-2产物通过增加血管通透性引起组织水肿，对白细胞具有明显的趋化作用。有报道认为，在AP的进展和严重程度方面COX-2是一个关键的早期炎症介质和早期反应基因模式，但其作用机制目前尚不完全明确。有关研究发现，其机制可能与AP时COX-2参与细胞调亡（apoptosis）有关。众多来自肿瘤及其他疾病的研究结果均表明，COX-2蛋白的过度激活与表达可抑制细胞凋亡。大量动物实验研究［7］显示，细胞凋亡与胰腺炎的轻重程度呈负相关。细胞凋亡对胰腺损伤有抑制作用。COX-2与炎症等病理过程密切相关，正常情况下体内不表达，是一种重要的前炎症介质。本资料结果显示，30例ABP患者的十二指肠黏膜组织COX-2蛋白表达阳性率重症组明显高于轻症组（P＜0.05）；经ERCP介入治疗术后COX-2 蛋白表达阳性率则明显降低（P＜0.05）。提示ABP患者发病机制与COX-2高表达密切相关。其作用机制可能为：COX-2高表达导致胰腺血流改变，诱发胰腺及小肠黏膜微循环障碍有关；另外，COX-2高表达还能引起胰腺血管内皮炎症；水解生物膜，破坏线粒体和溶酶体，从而导致疾病发生。而病情控制后，对应的COX-2表达减少，此与大量动物模型实验研究结果一致。

1 罗建华.Ranson评分系统在重症急性胰腺炎中的应用价值.华西医学，2008，23（ 5） ：1021～1022.

2 吴会军.胆道结石在胆源性胰腺炎中的处理方式探讨.中国医药导报，2008，5（6）：121.

3 樊斌，张家耀，张勇，等.急性胆源性胰腺炎的临床诊治分析.临床研究， 2013， 11（32）：349～350.

4 周文策.ERCP与急性胆源性胰腺炎的临床研究.兰州：兰州大学，2011.

5 Chen CC，Wang SS，Lee FY. Action of antiproteases on the inflammatory response in acute pancreatitis.2007，8（4Suppl） ：488～494.

6 Novovic S.Proinflammatory cytokines in alcohol or gallstone induced acute pancreatitis.2009， 10（ 3） ：256～262.

7 谢荣俊，张树友，李峰，等.急性胰腺炎时环氧化酶-2表达与腺泡细胞凋亡.中国现代医学杂志，2012，22（5）：15～18.

Objective To explore the infl uence of endoscopic retrograde cholangio-pancreatography （ERCP） for acute biliary pancreatitis （ABP），and the expression of cytokines and cyclooxygenase-2（COX-2）. Method 1. 30 patients with ABP from September 2012 to September 2013 were observed. According to the presence or absence of organ dysfunction or local complications，Ranson score less than or greater than 3 points，CT graded as A，B，C，D，E，divided 30 cases of patients with ABPinto mild acute pancreatitis（MAP） group and severe acute pancreatitis（SAP）group （22 of MAP，8 of SAP）. 2. By extracting blood and tissue of 30 patients before and 1 week after ERCP，test serum cytokines IL-6 using ELISA，and measure duodenal mucosa COX-2 protein expression by immunohistochemical techniques. Results In 30 cases of patients with ABP，the biochemical indicatorsof group postoperationdecreasedcomparede with group preoperation （P＜0.01） ； in 30 cases of patients with ABP，serum IL-6 expressed lower signifi cantly ingroup postoperationthan in group preoperation （P＜0.01），serum IL-6 expressed lower signifi cantly in group MAP expressed lower signifi cantly than group SAP （ P＜0.05）； in 30 cases of patients with ABP，the COX-2 protein of duodenal mucosa expressed lower significantlyingroup postoperationthan in group preoperation（P＜0.05），the COX-2 protein of duodenal mucosa in group MAP expressed lower signifi cantly than group SAP （P＜0.05）. Conclusion In 30 cases of patients with ABP，by ERCP treatment，the clinical manifestations and biochemical parameters improved signifi cantly； the expression of IL-6 and COX-2 is lower after ERCP treatment.

ERCP Acute biliary pancreatitis Interleukin-6 Cyclooxygenase-2

310053 浙江中医药大学
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1.3 操作器材 日本Olympus公司JF-260或TJF240电子十二指肠内镜及附件，日本全自动生化分析仪，武汉博士德生物公司IL-6 ELISA试剂盒（EK0410），COX-2蛋白单克隆抗体（SA1022）及免疫组化试剂盒（SA1052），自动洗板机，酶标仪，高精度加液器及一次性吸头，-80℃超低温冰箱，4℃冰箱，离心机。

1.4 ERCP操作方法 术前所有患者均行MRCP及上腹增强CT以了解梗阻部位及程度。禁食8～12h，常规行ERCP+EST+ENBD手术。EST 术后有利于钳夹、圈套操作，使胆石等顺利排出胆道。乳头气囊扩张术（EPBD）的原理是在十二指肠镜下沿造影管插入斑马导丝，沿导丝插入气囊导管达乳头内，使气囊中部恰好在乳头狭窄区，从气囊导管内注入生理盐水达5～8×760mmHg，扩张 2～3min，间隙30s后再扩张2min 即可使十二指肠乳头扩张。ERCP术时经电子十二指肠内镜，活检钳取十二指肠乳头旁组织1-2块，置于福尔马林固定液中保存。术后1周再次行ERCP术，再次钳取十二指肠乳头旁组织1-2块，置于福尔马林固定液中保存。标本以用于检测小肠黏膜COX-2蛋白表达。

1.5 ABP患者血清IL-6及十二指肠黏膜COX-2蛋白表达检测 （1）血清IL-6测定实验方法：ERCP术前当天清晨及术后7d分别空腹抽取静脉血，3ml保存于无菌抗凝试管内，3ml保存于无菌无抗凝试管内。抗凝管内血样即送生化室化验，检测肝功能指标：丙氨酸转氨酶（ALT）、天冬氨酸转氨酶（AST）、总胆红素（TBIL）、直接胆红素（DBIL）、γ-谷氨酰基转移酶（γ-GT）、血清淀粉酶（B-AMS）、血糖（GLU）。无抗凝管内血样经离心后（2000r/min，离心10min），取上清液于无菌试管中并置入-80℃冰箱保存，行批量测定IL-6。（2）十二指肠黏膜COX-2测定实验方法：术前术后标本固定后，制作石蜡切片，行免疫组化学SABC法，按试剂盒说明书操作，COX-2染色的阳性反应为细胞胞膜、胞浆中出现棕黄色颗粒。每张切片在400倍镜下随机选取5个视野，根据阳性细胞占视野总细胞数的比例分为4级。阴性：阳性细胞数＜10%；阳性：阳性细胞数≥10%。