甘亚宗

摘要：对一例犬细小病毒病从临床症状、实验室诊断以及防治措施等方面进行了介绍。

关键词：犬细小病毒病；诊断；防治

中图分类号：S858.292 文献标识码：B 文章编号：1007-273X（2016）05-0019-01

犬细小病毒病是犬的一种具有高度接触性传染的烈性传染病，临床上以急性出血性肠炎和心肌炎为特征。该病一年四季皆可发生，以发病急、病程短、传染性强、死亡率高为其特点，是危害我国养犬业最为严重的传染病之一[1]。

1 发病过程及临床症状

2015年12月，一只3月龄幼犬出现呕吐、腹泻、精神萎靡，粪便有明显血腥味，初步诊断为犬细小病毒病，对病犬进行隔离，进一步采用实验室检查确诊。

2 实验室检查

（1）材料：病犬粪便。

（2）主要仪器及试剂：PCR仪、凝胶成像分析仪、电泳仪等；SDS、蛋白酶K、苯酚、氯仿、无水乙醇、dNTPs、TaqDNA聚合酶（购自TaKaRa公司）。

（3）方法[2]。①CPV引物：上游引物，5′- GTACATTTAAATATGCCAGA -3′；下游引物，5′- ATTAATGTTCTATCCCATTG -3′。②病毒总DNA 的抽提：取1 g粪便，加入1 mL PBS液溶解，静置10 min，12 000 r/min 离心10 min；取上清液500 μL，加入50 μL 的SDS（10%），20 μL蛋白酶K（20 mg/mL），混匀，50 ℃水浴2 h，每20 min 摇匀一次。加入500 μL苯酚混匀，静置10 min，12 000 r/min离心10 min；取上清，加入等体积苯酚∶氯仿（1∶1），冰浴5 min，4 ℃ 12 000 r/min 离心5 min；取等体积氯仿冰浴5 min，4 ℃ 12 000 r/min离心5 min；取上清加入2.0～2.5 倍的无水乙醇及1/10体积的3 mol/L 的NaAc 混匀，置-20 ℃ 30 min或过夜，同上离心15 min；弃上清，加1 000 μL 75%乙醇，洗涤1 次。晾干EP 管中的DNA，加入30 μL的双蒸水溶解，-20 ℃保存备用。③PCR 反应体系与条件。PCR 反应体系：10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTPs （2.5 mmol/L）2.0 μL，MgCl2 （25 mmol/L）1.0 μL，上下游引物（25 pmol/L）各0.5 μL，DNA 模板5.0 μL，TaqDNA聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，加H2O 至25 μL。PCR 反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，45 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35 个循环；末次72 ℃再延伸10 min。反应结束后取7 μLPCR产物在1%的琼脂糖凝胶上电泳，在凝胶成像系统上观察。

（4）结果判定。采用PCR技术进行检测，结果见图1。利用犬二联弱毒苗作为阳性对照，结果显示阳性对照（标记1）与所检病料（标记3）均扩增出470 bp条带，与预期的目的条带大小一致，阴性对照（标记2）无任何条带（图1）。……