胡朝华，张 蕾，张又弛，万顺刚

(1.福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心，福建福州 350002；2.中国科学院城市环境研究所，福建厦门 361021)



新型纳米凝胶包被生物炭基固定化酶研究

胡朝华1，2，张 蕾1，张又弛2，万顺刚2

(1.福建农林大学国家甘蔗工程技术研究中心，福建福州 350002；2.中国科学院城市环境研究所，福建厦门 361021)

摘要[目的]探讨一种新型的脂肪酶固定化载体。[方法]采用酶底物类似物油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭表面，首次制备出一种新型高效的纳米凝胶包被生物炭基质作为脂肪酶酶固定化载体。[结果]通过油/水界面的活化效应激活脂肪酶分子的催化活性位点，并通过凝胶的溶胀/退溶胀作用增强脂肪酶的固定化效果，所制备的新型固定化脂肪酶的催化活性和催化稳定性都得到了充分提高。[结论]新型固定化脂肪酶为酶固定化技术研究提供了材料。

关键词纳米凝胶；油酸；固定化酶；催化活性

生物酶法是一种可用于转化生物柴油的环保高效型资源化技术。生物酶法是以脂肪酶为催化剂，在非水溶液体系中催化动植物油脂(脂肪酸甘油三酯)与短链醇合成脂肪酸单烷基酯(即生物柴油)，这种催化合成方法具有原料预处理简单、醇用量少、能耗低、产物分离回收方便以及环境友好等优点。然而，游离的脂肪酶往往催化活性和使用寿命不足，从而限制了其在催化制备生物柴油中的应用。目前，许多策略如脂肪酶分子修饰和酶固定化技术已被用于改善脂肪酶在非水溶液体系中的催化活性和稳定性。酶固定化技术由于能提高脂肪酶的催化性和重复使用效率，明显降低酶催化工艺的成本，因而已成为制备生物柴油的关键技术之一。

脂肪酶固定化载体和固定方法是影响固定化酶活性的2个重要因素[1-3]。然而，传统的脂肪酶固定化材料，包括已商业化的固定化脂肪酶Novozym435所采用的大孔丙烯酸树脂，往往采用惰性的无机或有机材料，这些酶固定载体及其固定化过程缺乏可调控性。与传统的惰性载体相比，智能化高分子材料(如温度敏感型水凝胶)是一类理想的酶固定载体，其在增加酶负载量、保持酶分子构象和催化活性、提高固定化酶再利用性等方面具有重要的应用价值。生物炭是一种低成本、多功能的环保材料，已被广泛用于温室气体减排、退化土壤改良、重金属和有机污染物的环境修复等领域，但有关生物炭载体用于固定化脂肪酶的研究鲜见报道。鉴于此，笔者采用生物炭和温敏性高分子凝胶，研制了一种新型高效的纳米凝胶包被生物炭基质作为脂肪酶酶固定载体，并初步研究了其催化特性，旨在为酶固定化技术的进一步研究与应用提供理论依据。

1材料与方法

1.1材料脂肪酶、棕榈酸对硝基苯酯购自Sigma公司；N-异丙基丙烯酰胺、N，N’-亚甲基双丙烯酰胺以及油酸钠购自百灵威试剂公司；曲拉通X-100、过硫酸钠、对硝基苯酚购自上海国药集团；其他试剂均为分析纯。

1.2方法

1.2.1油酸分子修饰的纳米凝胶合成。参考Sahiner等[4]的方法，分别称取一定量的N-异丙基丙烯酰胺、 N，N’-亚甲基双丙烯酰胺以及油酸钠，完全溶于去离子水中，加入曲拉通X-100作为乳化剂。通惰性气体，70 ℃下搅拌加热20～30 min后，加入过硫酸钠水溶液，继续搅拌热聚合反应3 h。将反应液体转移至透析袋，在水中透析至少48 h，转移透析液至离心管，-50 ℃冷冻冻干，所得产物即为油酸修饰的纳米凝胶颗粒。

1.2.2纳米凝胶包被生物炭基载体的制备。从闽南地区收集生物质废弃物，水洗干燥后粉碎过20目筛，在马弗炉中以10 ℃/min的升温速率加热到675 ℃，限氧热裂解4 h，裂解产物(即生物炭)作为酶固定化基质。将所得生物炭浸渍于“1.2.1”所得纳米凝胶悬液中，充分混合后，使纳米凝胶附着/包被在生物炭的表面，过滤收集沉淀，所得沉淀物真空干燥，即获得油酸修饰的纳米凝胶包被生物炭基载体。

1.2.3固定化酶的制备。将脂肪酶溶于磷酸缓冲液(pH 7，50.0 mmol/L)，充分溶解后，离心去除杂质，收集酶上清液，与所制备的纳米凝胶包被生物炭基载体混合，25 ℃下搅拌混匀后，250 r/min振荡3 h，使油酸分子修饰的纳米凝胶网络溶胀，通过油/水界面活化效应增强脂肪酶分子的催化活性。为了进一步提高活化脂肪酶在载体上的固定化效果，加入戊二醛(终浓度为1%)，35 ℃下磁力搅拌80 min，使载体上已活化的脂肪酶分子之间相互交联并定向固定下来。通过高速离心并反复用磷酸缓冲液洗涤后，收集沉淀物，-50 ℃冷冻干燥，即获得油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固定化脂肪酶。

1.2.4酶活测定。称取一定量棕榈酸对硝基苯酯溶解到异丙醇溶剂中，制备16.5 mmol/L棕榈酸对硝基苯酯的工作液。取上述溶液1.0 mL于圆底烧瓶中，加入9.0 mL磷酸缓冲液，再投入0.2 mL曲拉通X-100和10 mg阿拉伯胶。混匀后，在30～50 ℃的恒温水浴摇床中保育30 min，加入不同量的脂肪酶，恒温振荡培养。培养一定时间后，分取反应液并用预冷的去离子水稀释，高速离心使残留的蛋白酶及其载体完全沉积。收集上清液，在410 nm波长处比色分析对硝基苯酚的浓度。脂肪酶的催化水解活性用单位体积的酶活性单位(U/mL)来评估，1个酶活性单位定义为在上述条件下单位时间内产生1 μmol/L对硝基苯酚所需的酶量。

2结果与分析

2.1凝胶包被生物炭固定化酶载体的形貌结构通过分子表面修饰，研制出一种纳米凝胶表面包被的生物炭基固定化载体。油酸分子修饰的凝胶颗粒粒径主要分布在300～900 nm(图1a)。将所制备的纳米凝胶颗粒包被于生物炭表面后，纳米凝胶颗粒可均匀分散在生物炭表面(图1b)。通常，油酸分子可作为底物类似物激活脂肪酶分子的活性构象修饰，因此，将油酸修饰的凝胶颗粒包被生物炭并用于固定化酶，可充分提高固定化酶的催化活性及其稳定性。

注：a.纳米凝胶；b.凝胶包被生物炭。Note：a.Nanogel; b.Encapsulated biochar of gel.图1　纳米凝胶及其包被生物炭的扫描电镜形貌Fig.1　Scanning electron microscopy of nanogel and its encapsulated biochar

注：NH-MBC.凝胶包被酶固定化载体；MBC.未包被酶固定化载体。Note：NH-MBC.Immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme; MBC.Immobilized vector of noncapsulated enzyme.图2　纳米凝胶包被酶固定化载体与未包被载体的热失重曲线Fig.2　Thermo-gravimetric curves of immobilized vector of nanogel encapsulated lipase and noncapsulated vector

注：NH-MBC.凝胶包被酶固定化载体；MBC.未包被酶固定化载体。Note：NH-MBC.Immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme; MBC.Immobilized vector of noncapsulated enzyme.图3　纳米凝胶包被酶固定化载体与未包被载体的红外图谱Fig.3　Infrared spectrograms of immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme and noncapsulated vector

2.2凝胶包被生物炭固定化酶载体的热稳定性 热重分析仪和傅里叶红外光谱仪的测试结果表明，纳米凝胶包被处理增强了生物炭基固定化载体的热稳定性，同时并未改变酶固定化载体的表面功能基团。由图2可知，与对照未包被的酶固定化载体相比，纳米凝胶包被的固定化载体在热失重规律上基本一致，热失重初期由于载体内部所含自由水和结合水释放导致缓慢失重，然后基质分解逐渐失重。由图3可知，与未包被的酶固定化载体相比，纳米凝胶包被的炭基载体在1 600～1 560 cm-1和1 120～1 090 cm-1两位移处均有羧基和氨基峰的偏移，说明纳米凝胶包被处理未影响固定化载体表面官能基团的分布。

2.3凝胶包被生物炭固定化酶载体的组成分析由表1可知，纳米凝胶包被载体在酶固定处理前后，载体组分尤其是碳和氧含量存在明显差异。在脂肪酶固定前，纳米凝胶包被载体中含氮量比未包被载体增加了1.76倍，包被与未包被载体的含碳量、含氧量和含氢量的变异系数在3%～7%范围内。而固定化酶之后，2种固定化载体的含氮量都明显增加，包被载体的含氮量比未包被载体增加了70.6%，其中碳、氧含量的变异系数达6%～25%。

表1脂肪酶固定前后的未包被载体和纳米凝胶包被载体的元素组成

Table 1Element components of noncapsulated vector(MBC) and nanogel encapsulated vector(NH/MBC)

%

注：NH-MBC.凝胶包被酶固定化载体；MBC.未包被酶固定化载体。

Note：NH-MBC.Immobilized vector of nanogel encapsulated enzyme; MBC.Immobilized vector of noncapsulated enzyme.

2.4纳米凝胶包被生物炭固定化酶的催化性能生物炭表面经纳米凝胶包被修饰后，明显提高了固定化脂肪酶的水解催化活性。由图4可知，在不同催化反应温度条件下，采用油酸修饰的纳米胶包被生物炭固定脂肪酶的催化酯水解反应活性均明显高于非包被的生物炭基固定化脂肪酶。在该试验条件下(催化温度40 ℃)，比非包被的生物炭基固定化脂肪酶相比，同等量的纳米凝胶包被生物炭固定化脂肪酶的催化酯水解活性最高增加了45.3倍。

3结论

该研究首次报道了一种油酸分子修饰的纳米凝胶包被生物炭基固定化脂肪酶，新型固定化脂肪酶具有以下特点：①采用油酸分子修饰功能化载体的内外表面，通过油/水界面的活化效应增强脂肪酶分子活性构象与催化活性；②结合可控释水分子的温敏性高分子凝胶网络，保护脂肪酶活性并实现酶固定化过程的调控，提高脂肪酶的固定化效果和催化活性；③以生物质炭作为固定化基质，其生物质原料可再生，制备过程环保、经济；④新型固定化脂肪酶具有稳定的酶催化活性，并可重复利用，其制备方法简单、条件温和、成本低廉。

图4　催化反应温度对纳米凝胶包被生物炭基固定化酶(MC675/NOH/Lipase)与非包被生物炭基固定化酶(MC675/Lipase)的酶催化活性比较Fig.4　Enzyme catalytic activity comparison of catalytic reaction temperature to lipase immobilized with nanogel encapsulated biochar(MC675/NOH/Lipase) and lipase immobilized with noncapsulated biochar (MC675/Lipase)

参考文献

[2] GAO S，WANG Y，DIAO X，et al.Effect of pore diameter and cross-linking method on the immobilization efficiencyof Candida rugosa lipase in SBA-15[J].Bioresource technology，2010，101：3830-3837.

[3] KUO C H，PENG L T，KAN S C，et al.Lipase-immobilized biocatalytic membranes for biodiesel production[J].Bioresource technology 2013,145：229-232.

[4] SAHINER N，ALB A M，GRAVES R，et al.Core-shell nanohydrogel structures as tunable delivery systems[J].Polymer，2007，48：704-711.

基金项目福建省自然科学基金重点项目(2013Y0082，2013N0039)；浙江省宁波市自然科学基金项目(2013A610184)；福建省厦门市科技计划项目(3502Z20142019)。

作者简介胡朝华(1978- )，男，福建莆田人，博士，从事环境功能材料与资源化技术研究。

收稿日期2016-03-30

中图分类号TQ 426.1

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)13-014-03

Study on the Lipase Immobilized with Novel Nanogel Encapsulated Biochar

HU Chao-hua1,2, ZHANG Lei1, ZHANG You-chi2et al

(1. National Center of Engineering Research on Sugarcane, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002; 2. Institute of Urban Environment, Chinese Academy of Sciences, Xiamen, Fujian 361021)

Abstract[Objective] To discuss a novel lipase immobilized carrier. [Method] Novel nanogels modified with oleic acid were synthesized and encapsulated on the surface of biochar, which was used firstly as a kind of vectors to immobilize enzyme such as lipase. [Result] The catalytic activity and stability of the resulting immobilized lipase were improved adequately through activating the catalytic sites by oil/water interface effect, as well as immobilization approach using the swelling/deswelling properties of nanogels on biochar surfaces. [Conclusion] The novel immobilized lipase provides materials for the research on enzyme immobilization technology.

Key wordsNanogels; Oleic acid; Immobilized lipase; Catalytic activity