唐 颖, Gerald J.Smith

1. 北京工商大学北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 100048 2. School of Chemical and Physical Sciences, Victoria University of Wellington, PO Box 600, Wellington, New Zealand

中国人头发纤维在UVA紫外光老化中的光谱学研究

唐 颖1*, Gerald J.Smith2

1. 北京工商大学北京市植物资源研究开发重点实验室，北京 100048 2. School of Chemical and Physical Sciences, Victoria University of Wellington, PO Box 600, Wellington, New Zealand

生活中，日光中的紫外辐射是导致头发光老化/光损伤的重要环境因素。长时间光照可使染发和天然发出现包括颜色褪变在内的退行性变化。以中老年人的自然灰发为样本来源，通过分离和人工漂染处理，获得了包括自然发色、漂白和染黑的六种头发类型，经过UVA(320～400 nm)紫外光老化，采用漫反射光谱、三维荧光光谱和衰减全反射傅里叶变换红外光谱对头发纤维的老化特征进行无损分析，结合头发中光产生过氧化氢的定量分析，探讨了不同发色和漂染处理对头发耐光性的影响。结果表明，UVA辐照可通过Ⅱ型电子转移机制诱导头发中的光敏基团产生过氧化氢，导致纤维表面蛋白和色素分子的光氧化降解。自然发色与漂染发在光老化中的颜色变化不同： 灰发和白发主要发生光黄化，人工染发和漂白发分别发生光褪色和光漂白。高湿度环境能加速头发的光降解。化学漂染处理会使头发中的光致过氧化氢水平升高，使纤维处于较高的氧化压力从而影响头发的光稳定性； 而头发中的黑色素分子，包括天然黑色素和染发剂的人工黑色素，可能具有自由基产生与清除双重性。研究结果为建立中国人头发光损伤的光谱学评价方法和进一步研发针对国人发质的染护发产品提供了重要的实验基准数据。

头发纤维； UVA辐射； 漫反射光谱； 三维荧光光谱； ATR-FTIR； 过氧化氢

引 言

头发虽然是一种无生命的皮肤附属器，却与人们的形象息息相关，甚至影响心理健康。进入21世纪，我国人口的老龄化发展使染发人群不断扩大。然而，染发剂在美化形象的同时也带来了头发光敏感、褪色等问题。国外研究发现，染发的颜色和亮度在模拟日光照射后显著降低，其改变程度还与头发中原先黑色素的种类、含量和梳洗频率有关[1]。除了染发，天然头发也会受到光照的影响。Hoting等发现，头发颜色深浅不同，对光照的反应性也不同： 浅色发比深色发更容易受到紫外辐射的影响，漂白等化学处理能加快头发的光老化[2-4]。从光反应性上，头发可被看作是一个由角蛋白和色素组成的二元光化学体系，而日光中的紫外辐射对这两大成分的破坏是导致头发光损伤的主要原因[5]。其中，中波紫外线(UVB, 280～320 nm)能直接破坏毛小皮中的二硫键，主要损害头发的表面形态； 长波紫外线(UVA, 320～400 nm)主要通过光氧化反应造成包括颜色变化的更深层次损伤[6-8]。在特定波长的激发下，头发中的色氨酸等光敏性基团能通过Ⅰ型(电子转移)或Ⅱ型(能量转移)机制与空气中的氧发生光敏反应，产生包括单线态氧和过氧化氢等活性氧簇(ROS)[9]。ROS及其引发的自由基反应可氧化头发中的蛋白、脂质和色素成分，导致强度降低、表面粗糙、颜色减退、缺乏光泽等一系列光损伤表型的出现[7]。

目前，化妆品市场陆续推出许多针对染后发质的洗护产品，其中宣称具有防晒、抗褪色的产品特别受消费者青睐，具有极大的市场潜力[10]。然而，由于我国在头发的光老化方面的研究极少，相对于建立了比较完善的评价体系(如SPF指数)的皮肤防晒, 目前对头发的光损伤/光防护尚缺乏有效的评价方法。除了对颜色和表面形貌的物理表征，国外文献中还常使用紫外、荧光和红外等光谱技术分析头发中的色素和氨基酸成分变化。但由于头发样品的复杂性，研究中常采用破坏性的样品制备方法，实验结果的差异较大。另外，国外主要关注白种人的金发、棕发与红色系染发，其研究结果也不一定适合以黑发为主的中国。以我国中老年人的自然发和人工漂染发为对象，采用无损的制备方法，运用漫反射光谱、三维荧光光谱和衰减全反射傅里叶变换红外光谱(ATR-FTIR)对头发纤维的UVA紫外光老化进行了原位的快速表征，并结合对头发中光产生过氧化氢的定量分析，探讨了不同发色和漂染处理对头发耐光性的影响。这些数据为建立头发纤维光损伤的光谱学评价方法，进一步比较不同染护发产品的影响、研发针对中国人发质的发用化妆品提供了重要的理论与实验依据。

1 实验部分

1.1 样品处理

实验样本来源为采集自北京地区的20例汉族(年龄45～85岁，男女各半)的自然灰发(GH，白发比例30%～80%)，用蒸馏水超声清洗后，通过分离灰发中的黑发与白发、均匀混合不同供体的头发获得黑发(BH)、白发(WH)和白发比例50%的灰发(GH)样品； 然后对黑发样品进行漂白处理获得漂白发(BHB)样品，采用市售氧化型染发剂对灰发和漂白发进行人工染黑获得灰发染黑发(GHD)和漂白后染黑发(BHBD)，总共六种类型的头发样品。

(1)漂白过程： 称取同重量的欧莱雅双氧乳(含12%过氧化氢)和无尘香薰漂粉按1∶1比例调和后将混合液均匀覆盖在头发上，室温处理50 min后用蒸馏水将漂白发冲洗至中性pH值。

(2)染黑过程： 量取48 mL欧莱雅#1自然黑色染发霜(含对苯二胺)，与72 mL显色敷用剂配成摇匀染发剂，用刷子蘸取适量摇匀染发剂，刷在自然灰发或漂白发上，使其均匀覆盖，室温处理30 min后用蒸馏水将染黑发冲洗至中性pH值。

头发纤维由于表观粗细不均匀，纤维之间存在孔隙，影响光谱测量的准确性。为了克服这一困难，本文设计了针对头发样品的石英样品池(图1)，池中头发按同方向排列固定，填充用量少(约90～100 mg)，实现了对头发纤维光谱特征的无损、快速检测。

图1 头发样品石英样品池

1.2 UVA光老化

样品的人工光老化采用两根美国Spectronics公司XX-15A型长波UVA/15 W自滤色灯管，中心波长为365 nm。进行干老化时使用石英池装填样品，样品距离灯管10 cm，辐照强度2.85 mW·cm-2，辐照48 h。湿老化时称取100 mg头发样品用1 mL蒸馏水润湿后封于得力PE透明自封袋(100×70 mm，UVA区透光率80%～85%)中，与干老化一同结束后取出头发装填入石英池进行光谱分析。监控光老化过程中的环境温度为(30±5)℃，湿度为RH20%(干老化)～RH90%(湿老化)。

1.3 仪器及参数

漫反射光谱检测采用配备积分球附件的岛津UV-3150紫外-可见分光光度计(扫描步长1 nm，扫描范围300～800 nm)。采用Horiba公司的Fluorolog-3荧光光谱仪(Jobin Yvon)测定样品在“front-face”模式激发波长270～420 nm(间隔10 nm)的发射光谱(扫描步长2 nm，扫描范围300～600 nm)，然后使用Origin软件对原始光谱数据进行矩阵重构获得三维荧光等高线光谱。红外光谱检测采用美国Thermo Nicolet Avatar 370傅里叶变换红外光谱仪配备衰减全反射ATR附件。测试时将10根头发纤维紧压平铺于锗反射晶体上。光谱分辨率4 cm-1，光谱采集范围4 000～550 cm-1, 扫描信号累加50次。

1.4 光致过氧化氢分析

参照Millington的方法[11]对光照过程中产生的过氧化氢进行定量分析。该方法原理基于二价铁可被过氧化氢氧化生成三价铁，后者与二甲酚橙(Xylenol Orange，Sigma公司)生成紫色的络合物(λmax=560 nm)。测试时称取100 mg头发纤维用1 mL蒸馏水润湿后进行湿老化，然后从PE袋中抽取500 μL液体，用蒸馏水10倍稀释成5 mL加入10 mL工作溶液(由等比例的0.25 mol·L-1硫酸、0.1 mol·L-1山梨醇、1.0 mmol·L-1二甲酚橙和2.5 mmol·L-1硫酸亚铁铵溶液混合而成)，用水补足至25 mL。在室温下搅拌反应液45 min后，测其在560 nm的吸光值(A)。根据标准曲线：A=0.032 34c+0.001 2(R2=0.998)，计算样品中的过氧化氢浓度(c)。每个样品平行测试三次，同时以无光照条件下的吸光值作空白对照。

2 结果与讨论

2.1 漫反射光谱测定头发的颜色变化

采用紫外可见漫反射光谱对六种类型头发样本在UVA光老化48h前后的颜色变化进行了比较，实验数据如图2所示。研究结果发现，不同类型的头发纤维对UVA辐照的敏感程度和光变色反应具有明显差异，同一头发样品在不同湿度条件下的反应也不相同。光老化使三种自然发色(WH，GH和BH)在可见光区尤其是400～500 nm短波区的反射值减少，表明产生了吸收蓝色可见光的生色基团，从而导致视觉上的光黄化。相反地，漂染过的头发(BHB，GHD和BHBD)则表现出不同程度的反射值增加。其中，两种人工染发(GHD和BHBD)的反射值增加主要发生在短波可见光和近紫外区(300～500 nm)，说明该区段的色素分子发生了光降解，即光褪色。漂白发的反射值在整个紫外可见光区都有增加，表现为均匀的亮度增加，即光漂白。六种类型头发的共同特征是，在干燥条件下，反射值的变化并不明显，但在高湿度条件下谱图变化显著，说明头发在湿老化中比干老化更容易发生颜色改变。

图2 UVA辐照前后头发样品的反射光谱

2.2 头发的三维荧光指纹谱

首次应用三维荧光光谱技术，获得了六种类型头发样品的三维荧光谱图，如图3所示。在含有黑色素的样品(GH，BH，GHD和BHBD)中可观察到显著的两个荧光峰： (1)荧光峰A，激发波长Ex290 nm, 发射波长Em340 nm，属于色氨酸荧光峰； (2)荧光峰B，激发波长Ex330～400 nm, 发射波长Em400～480 nm，属于色氨酸的氧化代谢产物(主要成分为犬尿氨酸及衍生物)[12]。由于头发中黑色素对荧光的自吸收作用，随着发色的加深，荧光峰A在黑发和染黑发中发生了一定的拉伸和变形，而在无黑色素的白发和漂白样品中其信号被强荧光峰B所屏蔽。

比较不同头发样品谱图中荧光峰的数目、位置和UVA辐照前后的强度，结果如表1。在有色头发中，荧光峰A，色氨酸特征峰的出现位置一致，但在不同黑色素含量的头发中荧光强度不同： 浅色发中明显高于深色发。荧光峰B在不同着色的头发中的位置有显著差异： 发射波长400，450和480 nm处的荧光基团分别是： N-甲酰犬尿氨酸、犬尿氨酸和3-羟基犬尿素，均为色氨酸的氧化与代谢产物[12]。因此三维荧光光谱技术能提供头发纤维成分的指纹特征，据此可鉴别不同色素沉着和不同漂染处理的头发。

图3 六类头发纤维的三维荧光光谱

表1 48 h UVA辐照前后头发中的荧光特征峰

*Fluorescence intensity values were the averages of triple measurements

48 h紫外光老化后，头发中并没有新的荧光峰产生，而是原有荧光峰的强度发生了变化，且在自然发色与漂染处理头发中的改变不同： 在未经处理的黑白灰三个头发样品中，两个荧光峰的强度均显著降低，表明UVA辐照可使头发中的色氨酸和代谢物发生光降解； 在漂染发中，由于短波区人工色素分子的光降解(参见2.1反射光谱)，滤光作用下降，使光照后荧光峰强度反而增加。由此可知，头发中的荧光信号受到光吸收色素的影响，在利用荧光光谱分析头发表面基团变化时应结合反射光谱的数据综合考虑。

2.3 红外指纹图谱分析头发表面成分的变化

图4 UVA辐照前六类头发纤维的FTIR光谱

以酰胺Ⅰ带吸收峰为内标对FTIR谱图进行归一化处理，比较UVA辐照前后的头发纤维在1 140～1 000 cm-1指纹区的变化，如图5所示。指纹区有三个特征吸收峰1 041，1 075和1 120 cm-1，分别归属于磺基丙氨酸(R-SO3H)、胱氨酸单氧化物(R—S—SO—R)和胱氨酸二氧化物(R—S—SO2—R)[14]； 其中在BHB的单氧化物和二氧化物特征峰分别偏移到了1 082和1 114 cm-1。三个特征吸收峰在自然白发中的强度均高于灰发和黑发。1 041 cm-1吸收峰在经过漂白处理的头发(BHB和BHBD)中的强度明显高于其他样品。UVA辐照后，该吸收峰在除了BHB以外的头发样品中均表现为增强，表明UVA和过氧化氢都能使头发中胱氨酸的二硫键断裂产生半胱氨酸，后者易被氧化产生大量磺基丙氨酸。由于头发表面胱氨酸含量相对恒定(约11%～18%)，因此磺基丙氨酸可用来监测高硫蛋白的氧化程度。湿老化对磺基丙氨酸和胱氨酸单氧化物的产生有促进作用； 胱氨酸二氧化物在光照后的自然发和染发中也有不同程度的增加，但在经漂白处理的样品中呈下降趋势。

图5 48 h UVA辐照前后头发样品的FTIR指纹区谱图(通过在1 647 cm-1酰胺Ⅰ带的归一化处理获得)

Fig.5 FTIR fingerprint spectra of human hairs before and after 48 h of UVA irradiation. The spectra were normalized at 1 647 cm-1(the amide Ⅰ frequency)

2.4 头发中UVA光致过氧化氢的定量分析

如图6所示，UVA辐射能在所有头发类型中诱导过氧化氢的产生，其浓度随着辐照时间而增长。一方面，漂白发(BHB)的产量最高，漂白染黑发(BHBD)次之，说明强氧化剂损伤过的头发会产生更大的氧化压力进而影响光老化速率。另一方面，两种黑色染发的过氧化氢水平明显高于自然黑发，后者又高于不含黑色素的白发。结果表明，头发中的黑色素，包括天然黑色素和染料中的人工黑色素，可能具有一定光敏性，能通过Ⅱ型电子转移途径产生过氧化氢。有意思的是，白发的过氧化氢产生量高于含有黑色素的灰发。已有研究报道皮肤中的黑色素一方面可作为光敏剂催化过氧化氢等ROS的产生，一方面又对ROS有清除作用[9, 15]。因此，推测头发中的黑色素对ROS的光产生和清除可能处于一种动态的平衡，而这种平衡取决于黑色素的含量。在含量高的黑发中，黑色素主要表现为光敏性，诱发产生更高水平的过氧化氢； 而在含量较低的灰发中，黑色素对ROS的抑制/清除作用更强，因此其过氧化氢水平反而低于白发。

图6 UVA辐照诱导产生过氧化氢于头发接触的水中

Fig.6 Photogeneration of H2O2in water in contact with human hair fibers resulting from exposure to UVA radiation

3 结 论

运用紫外可见反射光谱、三维荧光光谱和衰减全反射红外光谱分析技术，以中国汉族人源的头发纤维为样本，获得了六类代表性头发的特征谱图，对头发在UVA人工光老化过程中的光损伤进行了原位、无损的光谱学检测。研究结果表明，UVA辐照诱导头发中的光敏基团通过Ⅱ型电子转移途径产生过氧化氢，导致纤维表面蛋白和色素分子的光氧化降解，其中，自然灰发和白发主要发生光黄化，人工染发和漂白发分别发生光褪色和光漂白。高湿度环境对光损伤有促进作用。首次对头发的光诱导过氧化氢水平进行了定量测定，结果发现，漂染处理会使头发处于较高的氧化压力从而影响头发的光稳定性； 而头发中的黑色素分子，包括天然黑色素和染发剂的人工黑色素，可能具有自由基产生与清除双重性。

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(Received Jun. 8, 2015; accepted Nov. 8, 2015)

*Corresponding author

Spectroscopic Investigation of Human Hair from Chinese Subjects During UVA Photoageing

TANG Ying1*, Gerald J.Smith2

1. Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, Beijing Technology and Business University, Beijing 100048, China 2. School of Chemical and Physical Sciences, Victoria University of Wellington, PO Box 600, Wellington, New Zealand

Since ultraviolet radiation is one of the major environmental factors that cause photoageing/photodamage, human hair, including both dyed and undyed hair, are subject to color change following extended exposure to sunlight. In the work described in this paper, six samples of human hair from Chinese volunteers that included untreated, bleached and dyed were subjected to accelerated ageing by exposure to UVA (320～400 nm) radiation. Changes to their chemical compositions during photoageing were non-destructively characterized by reflectance, 3D-fluorescence and attenuated total reflectance Fourier transform infrared (ATR-FTIR) spectroscopies. These techniques, together with a quantitative analysis of the photosensitized generation of hydrogen peroxide, were used to assess the effects of different hair color and bleaching/dyeing treatments on the light stability of hair fibers. The results suggest that UVA irradiation can induce the production of hydrogen peroxide via a type Ⅱ mechanism (electron transfer interaction between photosensitive protein groups in their excited states) and subsequent reaction with oxygen, resulting in photo-oxidative degradation of surface protein and pigments of the hair fiber. Hair fibers of natural or artificial color respond differently in terms of color change during photoageing. Natural white and gray hair fibers exhibited the usual photoyellowing; and chemically black-dyed and bleached hairs showed photofading and additional photobleaching, respectively. Irradiation of hair in the wet state was found to accelerate photodegradation. Chemical bleaching and oxidative dyeing processes were shown to promote the photoinduced production of hydrogen peroxide, which contribute to a higher level of oxidative stress and thereby affects the photostability of human hair. Pigment molecules in hair, including both the natural pigmentation of melanin and that produced by artificial dyes, are suggested to play a dual role, both in the production and in the scavenging of oxygen free radicals. The work is designed to contribute to the establishment of spectroscopic methods for assessing the extent of hair photodamage as well as providing a sound experimental data basis for the research and development of improved hair dyes and after-dye products for the Chinese cosmetic market.

Human hair; UVA radiation; Reflectance spectroscopy; 3D-fluorescence spectroscopy; ATR-FTIR; Hydrogen peroxide

2015-06-08，

2015-11-08

国家自然科学基金项目(51403006)和北京市自然科学基金项目(2144046)资助

唐 颖，女，1983年生，北京工商大学化妆品系副教授 e-mail： tangying@th.btbu.edu.cn *通讯联系人

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)06-1783-06