杨 娟，陈兰珍*，薛晓锋，吴黎明，李 熠，赵 静, 吴招斌，张妍楠

1. 中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093 2. 农业部蜂产品质量安全风险评估实验室(北京)，北京 100093 3. 农业部蜂产品质量监督检验测试中心(北京)，北京 100081 4. 国家农产品加工中心蜂产品加工分中心, 北京 102202

近红外光谱技术快速鉴别蜂胶品种的可行性研究

杨 娟1, 2，陈兰珍1, 2*，薛晓锋1, 2，吴黎明1, 2，李 熠1, 2，赵 静3, 吴招斌1, 2，张妍楠2

1. 中国农业科学院蜜蜂研究所，北京 100093 2. 农业部蜂产品质量安全风险评估实验室(北京)，北京 100093 3. 农业部蜂产品质量监督检验测试中心(北京)，北京 100081 4. 国家农产品加工中心蜂产品加工分中心, 北京 102202

不同植物源的蜂胶物质组成不同，其生理和药理活性也存在着一定的差异。目前主要是根据蜂胶中物质组成及其含量的不同来鉴别蜂胶植物源，存在着一些局限性。因此，建立一种快速、准确鉴别蜂胶植物源的方法具有重要的意义。以三种不同植物源的蜂胶(杨树型蜂胶、桦树型蜂胶和橡树型蜂胶)为研究对象，利用傅里叶变换近红外光谱仪对蜂胶的无水乙醇溶液进行光谱扫描，采用主成分分析结合马氏距离判别法和典型判别分析分别建立蜂胶品种的判别模型并对其性能进行检验。结果表明： 在经过光谱预处理和主成分分析后，得到最佳的光谱建模波段为4 500～12 000 cm-1,最佳的光谱预处理方法为一阶导数+Savitzky-Golay(7)平滑； 主成分分析结合马氏距离判别法建立的判别模型校正集和检验集的判别准确率分别为93.62%和82.61%； 典型判别分析建立的判别模型的判别准确率为91.4%，交叉检验的判别准确率为88.6%。由此可知，主成分分析结合马氏距离判别法与典型判别分析对蜂胶样品的分类效果均较好。近红外光谱技术结合化学计量学方法应用于蜂胶植物源的快速、准确鉴别具有一定的可行性和实用性。

近红外光谱技术； 蜂胶； 植物源鉴别； 主成分分析结合马氏距离判别法； 典型判别分析

引 言

蜂胶是蜜蜂从植物的茎、腋芽处采集的树脂，并混入自身上颚腺的分泌物、花粉和蜂蜡等物质，最终得到的一种具有特殊气味的黏性混合物[1]。蜂胶的化学成分复杂，并具有多种生物学活性，如抗氧化[2-3]、抗微生物[4]、免疫增强[5-6]、抗肿瘤、降血糖、降血脂[7-8]等。蜂胶作为一种独特而宝贵的纯天然保健食品资源和药源受到越来越广泛的关注。我国地域广阔，气候类型多变，不同气候条件下生长的产胶植物不同导致蜂胶的植物来源也不一样[9]。目前，普遍认为中国蜂胶的植物源主要是杨树、松树、柳树、桦树及桉树等[10]。研究表明，不同植物源的蜂胶无论是在营养组分还是生理、药理功能上都存在巨大差异[11]。对于蜂胶品种的鉴别技术，国内外的专家学者也进行了一些研究。早在1993年Tomás-Barberán等使用高效液相色谱法(HPLC)建立了37个蜂胶样品中黄酮类化合物的指纹图谱，根据蜂胶中所含黄酮类物质的差异，可对以杨树科和藤黄科作为植物源的蜂胶进行区分[12]。2013年Falcäo等[13]采用HPLC和液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)相结合，测定蜂胶中黄酮类的成分，发现山奈苷可以作为区别杨树蜂胶和岩蔷薇蜂胶的特征性物质。2014年Isidorov等[14]使用气相色谱-质谱法(GC-MS)测定了蜂胶提取液中黄酮类物质的成分，不仅可以有效地鉴定出植物源为白桦树和黄桦树的蜂胶样品，还可以检测出蜂胶样品中混合的胶源植物成分。

目前，蜂胶品种的鉴别技术主要使用的是HPLC，GC-MS，LC-MS/MS等，以上方法样品前处理比较繁琐，检测耗时，仪器操作复杂，不适用于大批量样品的快速鉴别。近红外光谱技术以其简便、快速、无损、高效等优势，已被广泛应用于农业、石油工业、食品及医药等领域[15-17]，但是在蜂胶品种的鉴别方面报道较少。本实验利用近红外光谱技术结合化学计量学方法，建立蜂胶品种的判别模型。并对模型进行优化探讨，同时对模型的鉴别和预测效果进行了检验，为蜂胶植物源鉴别提供了方法和理论上的参考。

1 实验部分

1.1 材料

实验所用蜂胶于2012年—2013年采自我国3个省份共70个样品，其中包括杨树胶28个(河南省、辽宁省)，橡树胶23个(云南西双版纳)，桦树胶19个(吉林省吉林市)。所选取的蜂场方圆5 km以内胶源植物相对单一，保证实验材料的真实性。

1.2 仪器与样品制备和光谱采集

MPA傅里叶变换近红外光谱仪(配备InGaAS检测器、液体光纤探头2 mm、OPUS 6.5)德国Bruker； 分析软件采用MATLAB R2009b，TQ Analyst V6.0 和SPSS 21.0。

称取0.1～0.3 g蜂胶样品，加入5～10 mL无水乙醇溶解，离心后取上清液过滤以用于近红外光谱数据采集。

近红外光谱仪检测参数设置为： 扫描范围4 500～12 000 cm-1、分辨率4 cm-1、扫描次数64次、采集模式为透反射。每个样品平行扫描3次，取平均值作为该样品的原始光谱。光谱采集过程中，以无水乙醇作为背景，扣除乙醇分子的振动吸收峰，使蜂胶中所含成分信息显现。

1.3 模型的建立

首先建立不同光谱预处理方法和不同光谱波段下蜂胶品种的鉴别模型，优化出最佳预处理方法和光谱建模波段； 计算光谱数据的主成分得分，最后使用光谱矩阵的得分向量进行马氏距离判别和典型判别分析，建立蜂胶样品的类模型； 最后对模型的分类效果进行检验。主成分分析法可以将蜂胶近红外光谱中可能重叠的物质信息提取出来并组成综合成分，避免建模过程中选择过多波长造成的过度拟合，减少数据量提高模型的准确度和运算速度。马氏距离判别法是对已知分类样品数据的识别学习，建立相应的识别规则，进而对未知样本进行判别； 典型判别分析首先将所有的样品进行分类建模，然后对模型进行交叉检验，计算模型的判别准确率。

2 结果与讨论

2.1 光谱预处理和主成分分析

图1所示为三种蜂胶样品的原始近红外光谱图，横坐标为波长范围，纵坐标为吸光度值。由图可知，不同的蜂胶样品主要化学物质在红外谱图中吸收峰的位置极为相似，但是其吸光度值有一定差异。5 800～6 200 cm-1附近是黄酮类苯环上C—H伸缩振动的一级倍频吸收； 4 650 cm-1附近是N—H振动合频的吸收带； 6 000 cm-1附近波段主要为C—H和H—O一级倍频与合频吸收； 5 200和7 000 cm-1是H—O的合频和二倍频的吸收带。

在建立蜂胶近红外光谱定性模型过程中，需要对建模波段进行选择，同时要选择一定的光谱预处理方法。光谱预处理可以将原始光谱中难以识别的信号进行变换函数处理，挖掘或归纳出原始光谱中隐含的特征性、细微性信息，降低那些信息量小、失真大的谱区对模型真实性和稳定性的影响。为使模型达到最佳的建模效果，本研究采用的是一阶导数+Savitzky-Golay(7)平滑对光谱进行预处理，光谱波段选择为4 500～12 000 cm-1。之后使用MATLAB软件计算蜂胶光谱的主成分得分，选取合适的因子个数，为接下来模型的建立提供有效的数据参考。

图1 蜂胶样品的近红外光谱图

表1 前十个主成份累计方差贡献率

Table 1 Ten principal components and accumulative reliabilities

主成分/%方差贡献率/%累计贡献率/%PC175.34575.345PC211.05186.396PC36.01792.413PC44.49696.909PC52.83599.744PC60.16999.913PC70.04999.962PC80.01899.980PC90.00499.984PC100.00299.986

首先利用近红外光谱仪自带的OPUS 6.5 软件将每个样品的近红外光谱转换为数据点，光谱波段从4 500～12 000 cm-1共有3 919个数据点，但是采用3 919数据点建模时，计算量大，而且光谱信息较弱的数据点会对判别模型的准确性和可靠性产生一定的影响，所以有必要对光谱数据进行主成分分析。主成分分析的结果如表2所示，随着因子数的增加主成分的累积方差贡献率也不断的增大，前10个主成分(principle component，PC)的累积贡献率达到99.986%，趋近100%，基本涵盖样品的信息。

2.2 主成分分析马氏距离判别模型

将70个蜂胶样品按照2∶1的比例随机分为校正集和检验集，校正集47个，检验集23个。采用前十个主成分因子结合马氏距离判别法建立蜂胶品种的判别模型，结果如表3所示。校正集与检验集的总体判别率分别为93.62%和82.61%，校正集中每个品种的蜂胶样品的判别准确率均在80%以上，表明所建立的判别模型具有较高的可靠性。检验集中橡树胶和桦树胶的判别准确率为100%，杨树胶的误判的概率较大，准确率为63.64%。

表2 主成分-马氏距离分析判别结果

图2为三种蜂胶样品的主成分分析马氏距离判别分析图，三种蜂胶样品大致落在三个不同的区域内，表现出较好的区分效果。杨树胶的样品分布介于橡树胶与桦树胶之间，样品的成分信息有一定部分的重叠； 由于有一部分杨树胶的样品采自辽宁，而且蜂蜜在采集的过程中不可能绝对的收集到单一品种的树胶，杨树胶中可能会混入一些其他的树胶成分，导致蜂胶品种间的差异减小，产生错判，降低了模型的型的判别准确率。

图2 主成分-马氏距离判别散点图

图3 典型判别分析散点图

2.3 典型判别分析

用前两个典型判别函数对各个样品做散点图，结果如图3所示。3个不同品种的蜂胶样品都围绕在组质心，且三个蜂胶品种的组质心能够较好的分开，没有相互重叠。从该图还可以直观看出，不同品种的蜂胶样品随品种集中的趋势非常明显。

使用采用前十个主成分因子结合典型判别分析建立蜂胶品种的判别模型，并对模型进行交互检验。结果如表3所示，模型对桦树胶、橡树胶和杨树胶的判别准确率分别为84.2%, 95.7%和92.9%，整体的判别准确率为91.4%，对模型进行交互检验的整体判别准确率为88.6%。

表3 典型判别分析结果

3 结 论

选取3个不同品种的蜂胶(杨树型蜂胶、桦树型蜂胶和橡树型蜂胶)为研究对象，结合一阶导数+S-G(7)平滑对光谱进行预处理，利用主成分分析结合马氏距离判别法和典型判别分析建立蜂胶品种的判别模型。马氏距离判别法建立的判别模型校正集与检验集准确率分别是93.62%和82.61%； 典型判别分析的判别准确率为91.4%，交叉检验的判别准确率为88.6%。结果表明，近红外光谱应用于蜂胶品种鉴别是可行的，而且检测效率和准确率较高，在蜂胶品种快速鉴别方面具有很大的应用前景。

使用近红外光谱技术鉴别蜂胶品种国内外的研究较少，处于初步的摸索阶段。为了提高模型的稳定性、适用性和广泛性，在后续的研究中会继续增加蜂胶样品的品种和数量，不断对模型进行修正和优化，建立统一化的模型标准，为我国蜂胶品种的快速鉴别提供一种高效低成本快速的新方法。

[1] Luo Chunying, Zou Xiaoli, Li Yuanqian, et al. Food Chemistry, 2011, 127(1): 314.

[2] Abu-Mellal A, Koolaji N, Duke R K, et al. Phytochemistry, 2012, 77: 251.

[3] ZHONG Li-ren, HAN Wen-hui, ZHANG Yan-ping(钟立人, 韩文辉, 张燕萍). Chinese Herbal Medicines(中草药), 2002, 33(9): 803.

[4] Mihai C M, Mrghita L A, Dezmirean D S, et al. J. Inverteb Pathol., 2012, 110(1): 68.

[5] Ohkura N, Takata Y, Ando K, et al. Journal of Apicultural Research, 2012, 51(2): 179.

[6] Orsatti C L, Sforcin J M. Natural Product Research, 2012, 26(5): 446.

[7] YANG Ming, SUI Dian-jun, SUN Hong, et al(杨 明, 隋殿军, 孙 红, 等). Chinese Herbal Medicines(中草药), 2006, 37(2): 253.

[8] LIU Fen, YUE Hai-tao, LÜ Wen-wei, et al(刘 芬, 岳海涛, 吕文伟, 等). Chinese Herbal Medicines(中草药), 2010, 41(4): 621.

[9] Shimomura K, Inui S, Sugiyama Y, et al. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 2012, 76(11): 2135.

[10] Usia T, Banskotaa H, Tezuka Y, et al. Journal of Natural Products, 2002, 65(5): 673.

[11] Sforcin J M. Journal of Ethnopharmacology, 2007, 113(1): 1.

[12] Tomás-Barberán F A, Ferreres F, Blazquez M A，et al. Journal of Chromatography A, 1993, 634(1): 41.

[13] Falcão S I, Tomás A, Vale N, et al. Industrial Crops and Products, 2013, 49: 805.

[14] Isidorov V A，Szczepaniak L，Bakier S. Food Chemistry, 2014, 142(1): 101.

[15] XIAO Yan-chun, DOU Sen(肖彦春，窦 森). Chinese Journal Analytical Chemistry(分析化学), 2007, 35(11): 1596.

[16] Laxalde J, Ruchebusch C, Devos O, et al. Analytica Chimica Acta，2011，705(1-2): 227.

[17] Nie Pengcheng, Wu Di, Yang Yan, et al. Journal of Food Engineering, 2012, 109(1): 155.

*Corresponding author

(Received Jan. 26, 2015; accepted May 6, 2015)

A Feasibility Study on the Discrimination of the Propolis Varieties Based on Near Infrared Spectroscopy

YANG Juan1, 2, CHEN Lan-zhen1, 2*, XUE Xiao-feng1, 2, WU Li-ming1, 2, LI Yi1, 2, ZHAO Jing3, WU Zhao-bin1, 2,ZHANG Yan-nan2

1. Institute of Apicultural Research，Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100093, China 2. Risk Assessment Laboratory for Bee Products Quality and Safety of Ministry of Agriculture (Beijing), Beijing 100093, China 3. Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-Products, Chinese Academy of Agricultural Sciences (Beijing), Beijing 100081, China 4. Apicultural Branch Center, Research and Development Center of National Agro-Food Processing Technology, Beijing 102202, China

Botanical origins of propolis are significant factors affecting biological and pharmacological activities because of different components in propolis. Until now, the determination of propolis botanical origins is mainly based on different varieties and the content of the compositions with great limitations. Therefore, it is important to discriminate different botanical origins of propolis quickly and accurately. In this study, Near-infrared (NIR) spectra of propolis varieties based on principal component analysis mahalanobis distance (PCA-mahalanobis distance) model and canonical discriminant analysis model were built for the classification of three botanical origins (poplar propolis，brich propolis and rubber propolis). The models were built based on the optimal pretreatment method and bands of first derivative + Savitzky-Golay (7) filter and 4500～12 000-1, which were selected in advance. After the principal component analysis, the correct classification rates of calibration sets and validation sets in analysis mahalanobis distance models were 93.62% and 82.61%, respectively. The discrimination rate and the cross-validation rate of canonical discrimination models were 91.4% and 88.6%, respectively. Therefore, NIR spectroscopy with chemometric methods is not only feasible but also practical for rapid and accurate identification of varieties of propolis.

Near infrared spectroscopy; Propolis; Botanical origins discrimination; PCA-mahlanobis distance; Canonical discriminate analysis

2015-01-26，

2015-05-06

公益性行业(农业)科研专项经费项目(S201203046)，国际原子能机构项目(IAEA)合作项目(16567-RO)，2015年国家特色农产品质量安全风险评估项目(GJFP2015010)资助

杨 娟，女，1991年生，中国农业科学院蜜蜂研究所硕士研究生 e-mail: 15600581748@163.com *通讯联系人 e-mail： chenlanzhen2005@126.com

TS207.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)06-1717-04