徐小峰，　曹学书，　陈　奇△，　吴　巍，　张志坚，　陈平波，　吴康健，　江　潮

1江苏大学附属医院骨科，镇江　2120002华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉　4300303江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江　212001

Toll样受体-3和 -4对干细胞成软骨分化的影响及机制*

徐小峰1，曹学书1，陈奇1△，吴巍2，张志坚3，陈平波1，吴康健1，江潮1

1江苏大学附属医院骨科，镇江2120002华中科技大学同济医学院附属同济医院骨科，武汉4300303江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江212001

摘要：目的探索Toll样受体(Toll like receptor，TLR)-3和-4在骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)成软骨分化过程中对蛋白多糖和Ⅱ型胶原蛋白形成的影响及机制。方法用Ficoll密度梯度离心法分离SD大鼠BMSCs，并进行传代扩增。流式细胞术检测细胞表面标志物CD34、CD44、CD54、CD90的表达进行细胞鉴定。以Western blot法检测第3代细胞的蛋白多糖和Ⅱ型胶原的表达。再随机分为空白组、TLR-3激活组、TLR-4激活组，分别以PBS、TLR-3激动剂、TLR-4激动剂处理后，进行成软骨诱导培养。培养第14天，以阿利新蓝染色检测蛋白多糖，以免疫荧光及Western blot法检测Ⅱ型胶原的表达，以实时荧光定量PCR检测Sox-9的表达。结果Ficoll密度梯度离心法分离所得细胞，其表面标志物表达为CD34(-)、CD44(+)、CD54(+)、CD90(+)，符合BMSCs特点。分组处理前，BMSCs不表达蛋白多糖及Ⅱ型胶原。经过2周成软骨诱导培养，空白组、TLR-3激活组和TLR-4激活组阿利新蓝染色均为阳性，且3组间无明显差异。免疫荧光及Western blot结果显示，3组均表达Ⅱ型胶原，但空白组表达明显低于TLR-3激活组和TLR-4激活组，且TLR组间无明显差异。PCR结果显示，TLR-3和TLR-4激活组Sox-9相对表达量较空白组增高1倍，而TLR组之间无明显差异。……