徐秀玉，程来亮，金立桥，孙　山*，刘美君

(1 山东省果树研究所，山东泰安271000；2 山东农业大学生命科学学院，山东泰安271018)

AOX途径在苹果离体叶片失水过程中的光破坏防御作用

徐秀玉1,2，程来亮1，金立桥2，孙山1*，刘美君2

(1 山东省果树研究所，山东泰安271000；2 山东农业大学生命科学学院，山东泰安271018)

摘要:为探讨线粒体交替氧化酶呼吸途径(AOX途径)对水分胁迫下苹果叶片光破坏的防御作用，以苹果砧木平邑甜茶离体叶片为试材，通过AOX抑制剂水杨基羟肟酸(SHAM)处理，同时测定苹果叶片叶绿素荧光诱导动力学曲线和820 nm光的吸收曲线，结合JIP-test分析，探讨了失水过程中AOX途径的光保护作用。结果表明：水分胁迫条件下，平邑甜茶叶片的AOX活性显著增加， SHAM抑制AOX途径后，叶片发生更严重的光抑制；在失水胁迫条件下，平邑甜茶叶片PSⅡ原初光化学反应的量子产额(TRo/ABS)、PSⅡ捕获的电子从QA传递到QB的概率(ETo/TRo)下降，PSⅡ单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)上升，而PSⅠ的最大氧化还原活性(ΔI/Io)未受影响；SHAM抑制AOX途径后，TRo/ABS和ETo/TRo进一步下降，ABS/RC进一步上升，同时引起了ΔI/Io的下降。研究认为，水分胁迫条件下，平邑甜茶叶片PSⅡ发生了光抑制，而SHAM处理在加重PSⅡ光抑制的同时，引起了PSⅠ的光抑制；叶片失水过程中，AOX呼吸上调是平邑甜茶叶片的重要光破坏防御机制，特别是对PSⅠ具有重要的保护作用。

关键词:苹果；平邑甜茶；失水；交替呼吸途径；光破坏防御

随着全球变暖和环境恶化，干旱问题日益严重[1]。干旱会引起植物叶片失水，发生光抑制，导致过剩光能的增加，严重时可引起植物光合器官的光破坏[2-4]。在长期的进化过程中，植物进化出一系列的光破坏防御机制，从而保护光合机构免受过剩光能的伤害，以前的光破坏防御研究多集中于叶绿体内，例如环式电子传递[5]、依赖叶黄素循环的热耗散[6]、Mehler反应[7]及活性氧的酶促和非酶促清除系统等[8]，而对于叶绿体外的光破坏防御机制研究甚少。近年的研究发现，线粒体中的AOX途径能够有效地消耗叶绿体内的过剩还原力，从而缓解强光对叶片造成的光抑制[9-10]。AOX途径的光破坏防御作用已在拟南芥、小麦、黄瓜等草本植物上被实验证实[11-13]，但其在木本植物中是否仍具有重要的光破坏防御作用尚未见报道。

苹果是中国重要的落叶果树树种，大多分布在干旱、半干旱地区，其生长过程中经常遭遇到干旱胁迫。有关干旱胁迫对苹果属植物的形态和生理生化指标等方面的影响已有大量报道[14-16]，而干旱胁迫下的光破坏防御机制研究相对较少。李春霞等研究发现干旱胁迫下苹果属植物热耗散增加[17]，Jia等证实干旱环境下光呼吸、米勒反应的增加可减轻苹果叶片的光抑制[18]，但AOX途径对干旱胁迫下苹果属植物光破坏防御的影响目前尚未见报道。因此，本研究选用苹果优良砧木平邑甜茶离体叶片作试材，探讨AOX呼吸途径的光破坏防御作用，以期为苹果抗旱栽培和育种提供理论依据。

1材料和方法

1.1试验材料

试验材料为种植于山东省果树研究所试验场的2年生平邑甜茶(Malus hupehensis)，于2014～2015年生长季选取长势一致的苗木，取第3～4片完全展开叶，用湿纱布包裹后，快速带回实验室用于试验。

1.2试验处理

将叶片用直径1.0cm的打孔器打成叶圆片，平均分为两组，一组浸泡于清水中(CK)，另一组浸泡于2mmol·L-1的水杨基羟戊酸(SHAM)溶液中，黑暗处理2h；然后将叶圆片表面擦拭干净，漂浮在20%PEG溶液上，让其自然脱水；脱水处理的同时用微波硫灯(MSL1000N1，宁波)进行1 000μmol·m-2·s-1的光照处理(光响应曲线的饱和光强)。分别在脱水处理的0、2、4h时取样进行相关参数测定。

1.3测定指标及方法

1.3.1叶片水势将叶圆片表面擦干，放入C-52样品室，平衡60min后，用PSYPRO水势仪(WESCOR，美国)进行水势测定。

1.3.2交替呼吸速率根据孟祥龙等[19]的方法，利用OXYTHERM氧电极(Hansatech，英国)，在25 ℃条件下测定呼吸速率，反应室温度由OXYTHERM氧电极的控温装置自动控制。于反应杯中添加2mL磷酸缓冲液(pH6.8)，加入直径1.0cm的叶圆片，在黑暗中测定叶片的耗氧速率，当耗氧速率达到稳定状态后，根据10～20min区间氧气浓度的下降斜率计算叶片总呼吸速率(Rtotal)；总呼吸速率测定后，重新在反应杯中加入2mL含有20mmol·L-1SHAM的磷酸缓冲液(pH6.8)，加入叶圆片，于25 ℃条件下恒温20min，在黑暗中测定叶片的耗氧速率，当耗氧速率达到稳定状态后，根据10～20min区间氧气浓度的下降斜率计算叶片COX途径呼吸速率(RCOX)。AOX途径呼吸速率(RAOX)=Rtotal-RCOX。根据上述方法分别测定经过不同脱水时间处理之后的总呼吸速率、AOX途径呼吸速率和COX呼吸速率。

1.3.3瞬时荧光和820nm光吸收动力学曲线瞬时荧光和820nm光反射用MPEA-2多功能植物效率分析仪(Hansatech, 英国)测量。测定参照Strasser等[20]的方法，先在5 000μmol·m-2·s-1的饱和红光下测量瞬时荧光；然后关掉红光，在1 000μmol·m-2·s-1的远红光下测量820nm光反射。

根据Strasser等[21-22]建立的JIP-test数据分析方法，对获得的OJIP荧光诱导动力学曲线进行分析，按下列公式计算相对可变荧光的差值(ΔVt)、单位反应中心吸收的光能(ABS/RC)、K点的相对可变荧光(WK)、反应中心捕获的量子产额(TRo/ABS)、捕获能量中用于电子传递的量子产额(ETo/TRo)等参数：

ΔVt=Δ[(Ft-FO)/( Fm- FO)]；

ABS/RC=4×(FK-FO)×FM/(FJ-FO)/ (FM-FO);

WK=(FK-FO)/(FJ-FO)；

TRo/ABS=(FM-FO)/FM;

3.1.1 如果对手竞技水平相对于自己较差，这样运动员往往会出现精神状态不紧张、攻击意识不强、低估敌人的能力现象，认为自己可以自由发挥，轻而易举就能拿下比赛。对自己也没有了进攻和防守的欲望。这时球员在身体和心理上都是非常放松的状态，慢慢这场比赛输的风险被逐渐显露出来，那么一旦比赛处于不利状态，情绪开始暴躁，心理也受到了波动，比赛节奏已经超出控制，逐渐失去自我控制。这时的运动员很难再回到合适的比赛状态。（见表1）

ETo/TRo=(FM-FJ)/(FM-FO)；

其中, FM=FP，FO、FK、FJ和FP分别为暗适应后20μs、300μs、3ms和30ms及最大瞬时荧光值。

根据820nm的光吸收曲线(由735±15nm的远红光诱导)，以820nm光吸收的最大值和最小值差值的相对值(ΔI/I0)作为衡量PSⅠ 最大氧化还原能力的指标。

1.4数据处理

采用MicrosoftExcel2003软件对数据进行处理和绘图，采用DPS软件对不同处理的测定结果进行统计分析。采用最小差异显著法(LSD,α=0.05)比较不同处理之间的差异显著性。

2结果与分析

2.1强光下脱水和SHAM处理对平邑甜茶叶片水势的影响

图1显示，平邑甜茶离体叶片的水势随脱水时间的延长而逐渐下降，其在脱水前、脱水2h和脱水4h分别约为-0.5MPa,、-0.8MPa和-1.5MPa，且其间均存在显著性差异(P<0.05)。整个脱水处理过程中，对照组和SHAM处理组之间叶片水势不存在显著差异。

2.2强光下脱水和SHAM处理对平邑甜茶叶片不同呼吸途径的影响

从表1可以看出，随着水分胁迫程度的增加，对照组平邑甜茶叶片的总呼吸和AOX呼吸均显著升高，与脱水前相比，脱水2h时总呼吸和AOX呼吸分别上调了15.1%和41.7%，脱水4h时分别上调了29.4%和83.7%。而同期COX呼吸途径的活性虽然轻微增加(P>0.05)，但其所占总呼吸的比例不升反而显著下降。而SHAM处理组的平邑甜茶叶片总呼吸速率和AOX呼吸速率明显下降，且整个脱水过程中SHAM对AOX途径抑制效果稳定。这表明脱水过程中平邑甜茶叶片总呼吸的增加主要是由于AOX呼吸途径增加导致的。

不同小写字母表示处理时间之间在0.05水平存在显著性差异；下同图1　强光下脱水过程中平邑甜茶叶片水势的变化The different normal letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level.The same as belowFig. 1　Changes in the water potential of M. hupehensis leaves during dehydration with light

处理Treatment脱水时间Dehydrationtime/h总呼吸Totalrespiration/(μmol·m-2·s-1)AOX呼吸AOXrespiration/(μmol·m-2·s-1)COX呼吸COXrespiration/(μmol·m-2·s-1)AOX呼吸/总呼吸AOXrespiration/Totalrespiration/%COX呼吸/总呼吸COXrespiration/Totalrespiration/%CK02.92±0.45c0.78±0.13c2.14±0.32a27±4c73±10a23.36±0.21b1.11±0.08b2.25±0.13a33±2b67±9b43.78±0.48a1.45±0.13a2.34±0.35a38±3a62±10bSHAM02.47±0.25b0.32±0.05b2.16±0.21a13±3d87±11a22.74±0.33a0.43±0.03a2.31±0.3a16±2d84±10a42.84±0.32a0.49±0.05a2.36±0.27a17±4d83±11a

注：不同字母表示同一处理不同脱水时间之间在0.05水平存在显著性差异；下同

Note:Differentlettersinthesametreatmentbutdifferentdehydrationtimesindicatesignificantdifferenceamongtreatmentsat0.05level；Thesameasbelow.

2.3强光下脱水及SHAM处理对平邑甜茶叶片快速叶绿素荧光诱导曲线的影响

2.4强光下脱水及SHAM处理对平邑甜茶叶片的叶绿素荧光参数的影响

为了阐明水分胁迫下，AOX呼吸途径对平邑甜茶叶片PSⅡ反应中心和光合电子传递链的影响，进一步分析了相关的叶绿素荧光参数。由图3，A可以看出，随着脱水程度的增加，反映PSⅡ最大光化学效率的参数(TRo/ABS)逐渐下降， 而SHAM处理的TRo/ABS进一步下降，表明失水胁迫下平邑甜茶叶片发生了光抑制，而抑制AOX途径后加重了失水胁迫下的光抑制程度。同时，WK的上升可作为叶片光合电子传递链P680供体侧受抑的标志，且与放氧复合体(OEC)的受损有关[21-22]。在脱水过程中，脱水处理和SHAM处理均未使平邑甜茶叶片WK出现明显差异(图3，B)，说明脱水处理和脱水过程中抑制AOX途径处理对PSⅡ供体侧均无明显影响。另外，随着脱水处理时间的延长，平邑甜茶叶片的ABS/RC显著升高，而其ETo/TRo显著下降；而SHAM处理进一步加剧了叶片ABS/RC升高和ETo/TRo下降的幅度，且大多达到显著水平。这表明脱水过程中抑制AOX途径后进一步降低了PSⅡ的光能吸收、转换和两个光系统之间的电子传递。

图2　SHAM处理下脱水过程中平邑甜茶叶片快速叶绿素荧光诱导动力学曲线的变化Fig. 2　Changes of the fast chlorophyll a fluorescence transient in M. hupehensis leaves during dehydration andSHAM application

图3　SHAM处理下脱水过程中平邑甜茶叶片的快速叶绿素荧光参数的变化Fig. 3　Changes of the prompt fluorescence parameters in M. hupehensis leaves during dehydration and SHAM application

图4　SHAM处理下脱水过程中平邑甜茶叶片820 nm 光反射(远红光测定)的变化Fig. 4　Changes of kinetic curves of modulated 820 nm reflection (measured with far red light) in M. hupehensis leaves during dehydration and SHAM application

2.5强光下脱水及SHAM处理对平邑甜茶叶片PSⅠ活性的影响

单纯的水分胁迫并未使远红光诱导的820nm光吸收曲线的形状发生明显变化(图4，A)；而用SHAM抑制AOX途径后，随着水分胁迫程度的增加， 820nm光吸收曲线的振幅逐渐变小(图4，B)。同时，ΔI/Io反映了PSⅠ反应中心P700的最大氧化还原能力，表示PSⅠ的活性[23]。由图5可知，随着脱水时间的延长，对照组平邑甜茶叶片PSⅠ的活性没有显著影响；在正常水分条件下(0h)，AOX途径受抑对平邑甜茶叶片PSⅠ的活性也没有显著影响，但在水分胁迫下，抑制AOX呼吸显著降低了PSⅠ的活性，且时间越长抑制程度越严重。以上结果说明平邑甜茶叶片PSⅠ 在强光及脱水胁迫下未发生光抑制，而其在SHAM抑制AOX途径后和脱水胁迫下却发生光抑制，且脱水胁迫时间越长，PSⅠ光抑制越严重。

3讨论

本研究结果表明，强光下平邑甜茶叶片线粒体中AOX的活性随着脱水胁迫程度的增加而明显上升；当抑制AOX途径后，进一步加重了平邑甜茶叶片脱水过程中的光抑制，说明脱水胁迫下，线粒体中AOX途径在平邑甜茶的光破坏防御中起着重要的作用。已有研究发现，低温、高温、干旱、病原菌感染等逆境胁迫会诱导植物AOX活性的上调[12，24-26]，推测这可能是由于逆境胁迫下呼吸链复合物过度还原将导致活性氧的产生，植物可通过激活AOX途径来维持电子传递能力，降低氧化损伤[27]。但以上对逆境下AOX的研究大都集中在拟南芥、小麦、豌豆等草本植物，木本植物中并未探究。本实验首次在木本植物中证明了干旱胁迫下AOX活性上升这一点。

图5　SHAM处理下失水胁迫下平邑甜茶叶片PSⅠ最大氧化还原能力(ΔI/Io)的变化Fig. 5　Changes of the maximum PSⅠ redox activity (ΔI/Io) of M. hupehensis leaves during dehydration and SHAM application

以往关于干旱下AOX途径的研究大部分是将AOX途径作为一条纯粹的呼吸电子传递链，关注的焦点多放在代谢、产热、抗病以及活性氧的产生和消耗方面[28-30]，但对AOX途径的光破坏防御作用极少研究。虽然Carlos等研究了干旱下AOX途径能保护光合电子传递[12]，但该研究并未探究干旱下AOX途径对光合系统具体的保护位点。我们知道，光合作用电子传递是由PSⅠ和PSⅡ协调作用共同完成的，无论是PSⅠ还是PSⅡ受到伤害，都会导致光合能力的下降。为了探讨干旱下AOX途径对光合电子传递具体的保护位点，我们接下来分析了荧光参数。

叶绿素荧光诱导动力学曲线中K点的出现是PSⅡ供体侧放氧复合体(OEC)受伤害的一个标志[31]；PSII捕获能量中用于电子传递的量子产额(ETo/TRo)，与PQ库氧化还原的比例有关[32]。本研究中，脱水及SHAM处理均未引起WK发生明显变化，说明水分胁迫和SHAM处理对平邑甜茶叶片PSⅡ供体侧没有明显影响。但SHAM处理后进一步增加了叶片脱水过程中ABS/RC的上升，说明AOX途径受抑后进一步加剧了PSⅡ反应中心的失活，即AOX途径对失水过程中的PSⅡ反应中心具有一定的保护作用；而SHAM处理后ETo/TRo的下降又说明AOX受抑后降低了水分胁迫下PSⅡ与PSⅠ之间电子传递。

PSⅠ受体侧的电子传递，除了受PSⅡ活性和受体侧电子传递体的影响外，同时也受PSⅠ活性的影响[33]。PSⅠ光抑制的典型指标是其最大氧化还原能力(ΔI/Io)的下降[31]。本研究中，ΔI/Io在水分胁迫下并无明显变化，而用SHAM抑制AOX途径后，ΔI/Io显著下降，说明AOX途径对脱水叶片的PSⅠ具有重要的保护作用。

综上所述，线粒体中AOX活性的主动上调，在水分胁迫下平邑甜茶叶片的光破坏防御中发挥着重要的作用，特别是对PSⅠ具有重要的保护作用。至于干旱胁迫下AOX途径在苹果属植物中具体的光破坏防御机制，我们将进一步研究。

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(编辑:裴阿卫)

RoleofMitochondrialAlternativeOxidase(AOX)inPhotoprotectioninAppleDetachedLeafunderWaterStress

XUXiuyu1,2,CHENGLailiang1,JINLiqiao2,SUNShan1*,LIUMeijun2

(1ShandongInstituteofPomology,Taian,Shandong271000,China; 2CollegeofLifeScience,ShandongAgriculturalUniversity,Taian,Shandong271018,China)

Abstract:The purpose of this study is to explore the role of mitochondrial alternative oxidase (AOX) in photoprotection in apple leaves under water stress. After treated with salicylhydroxamic acid (SHAM) to inhibit the AOX pathway, we studied the effects of AOX pathway on photoprotection in Malus hupehensis detached leaves under water stress by simultaneously analyzing chlorophyll a fluorescence transient and light absorbance at 820 nm. The results indicated that water stress induced the up-regulation of AOX activity. The inhibition of AOX pathway caused more severe photoinhibition. Under water stress, maximum quantum yield of primary PSⅡ photochemistry (TRo/ABS) and PSⅡ trapped electron being transferred from QA to QB (ETo/TRo) decreased, average absorbed photon flux per PSⅡ reaction center (ABS/RC) increased, while the maximum PSⅠ redox acitity(ΔI/Io) was not affected. After treated with SHAM to inhibit the AOX pathway, ABS/RC markedly increased, TRo/ABS, ETo/TRo as well as ΔI/Io significantly decreased. It was indicated that under water stress the inhibition of AOX pathway caused more severe photoinhibition, especially to the PSⅠ. Generally, the results demonstrate that the AOX pathway played an important role in the photoprotection in M. hupehensis leaves under water stress, particularly in the photoprotection of PSⅠ.

Key words:apple；Malus hupehensis Rehd.; water stress; mitochondrial alternative oxidase; photoprotection

文章编号:1000-4025(2016)05-0964-07

doi:10.7606/j.issn.1000-4025.2016.05.0964

收稿日期:2016-01-25;修改稿收到日期:2016-04-30

基金项目:山东省自然科学基金(ZR2012CM039)、泰山学者建设工程专项经费和作物生物学国家重点实验室开放基金(2012KF05)

作者简介:徐秀玉(1988-)，女，博士研究生，主要从事光合作用与抗逆生理方面的研究。E-mail:xxy555111@163.com *通信作者:孙山，博士，研究员，主要从事果树生理与品质资源研究。E-mail:sunshan03@163.com

中图分类号:Q945.78

文献标志码:A