袁新荣，左强强，冯琴，潘泽民（.克拉玛依市第二人民医院 检验科，新疆 克拉玛依 834007；2.石河子大学医学院 生物化学教研室，新疆 石河子832002）



HS3ST2基因启动子甲基化与新疆维吾尔族妇女子宫颈癌的相关性

袁新荣1，左强强1，冯琴1，潘泽民2Δ
（1.克拉玛依市第二人民医院 检验科，新疆 克拉玛依 834007；2.石河子大学医学院 生物化学教研室，新疆 石河子832002）

摘要：目的 探讨HS3ST2基因启动子甲基化与新疆维吾尔族妇女子宫颈癌的相关性以及早期诊断的可行性.分析HS3ST2基因甲基化对mRNA表达的影响。方法 采用甲基化特异性PCR方法和HPV16，HPV18特异的PCR方法分别检测了40例正常子宫颈组织，40例新疆维吾尔族妇女子宫颈癌组织的HS3ST2基因启动子甲基化情况和高危险性HPV的感染情况。用RT-PCR方法检测了10例甲基化阳性和10例甲基化阴性的组织HS3ST2基因的mRNA表达情况。结果 37例宫颈癌组织，发生HS3ST2基因启动子甲基化，正常组织没有发生甲基化，相应的高危险性HPV（HPV16，HPV18）的感染例数分别为27、5例.40例宫颈癌组织，在10例甲基化阳性的组织中HS3ST2基因mRNA的表达水平明显低于10例甲基化阴性的组织。结论 HS3ST2基因启动子甲基化可能是维吾尔族宫颈癌发生关键分子标志，具有大规模临床试验和早期子宫颈癌筛查的临床应用潜力。

关键词：HS3ST2基因；新疆维吾尔族妇女；基因启动子甲基化；HPV；子宫颈癌

宫颈癌是女性常见肿瘤，是全球范围内导致女性死亡的重要疾病，并且有年轻化趋势。人类乳头状瘤病毒（HPV）感染与宫颈癌高度相关，被认为是必要条件，已用其进行子宫颈癌筛查，但是其特异性尤其是对于年轻女性的筛查相对较低。当前，大量的科学报道发现，抑癌基因启动子甲基化可能在宫颈癌的发生中起了重要作用［1、2］。 硫酸乙酰肝素3-O-磺基转移酶2基因（heparan sulfate 3-O-sulfotransferase 2，HS3ST2）是新近发现的一个抑癌基因，在细胞的机械支持、粘附、运动、增殖、分化和形态形成中起重要作用［3］。近来研究显示，HS3ST2基因启动子CpG岛甲基化率在多种肿瘤中处于很高的状态［4，5］，具有作为早期诊断宫颈癌分子标志物的潜力。但是HS3ST2 基因在宫颈癌中的作用机制尚不清楚，因此，本文分析HS3ST2基因启动子甲基化，HPV16，HPV18（High-risk HPV，hr-HPV）感染和HS3ST2 mRNA表达的关系，以进一步认识其作用机制。

1　材料与方法

1.1研究对象

所有标本来自2009-2012年期间新疆医科大学附属中医院，石河子大学附属医院及克拉玛依市第二人民医院未经过化疗和放疗的维吾尔族妇女宫颈手术切除的新鲜组织标本和活检新鲜组织标本，所有取材均取得患者同意。

1.2DNA的提取

用SK1252基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物工程技术服务有限公司）提取组织DNA。步骤按说明书进行。

1.3DNA的亚硫酸氢盐修饰

参照CpGenomeTM DNA Modification Kit S7820试剂盒（美国Chemicon公司）手册说明对DNA进行亚硫酸氢盐处理修饰并纯化，修饰后的DNA置-80℃保存。

1.4甲基化特异性PCR

甲基化和非甲基化正向和反向引物序列参照文献，使用 Bio-Rad 梯度PCR仪进行扩增，康为世纪PCR反应Mix，反应条件：先95℃×5 min，再94℃×1 min，58℃×1 min，72℃×1min，共34个循环，最后72℃ 延伸 10 min。最后使用2％的琼脂糖凝胶电泳分析实验结果。

1.5RNA的提取

取出-80℃保存的子宫颈甲基化阳性和阴性的组织各10例，每例样本取30mg，使用液氮在研钵中研成粉末，用Trizol法提取 RNA。

1.6RT-PCR

将提取的 RNA使用reverse transcriptase（Fermentas，Hanover，MD，USA）试剂盒逆转录为cDNA。反应条件：95℃×5 min：94℃×30 s：58℃×30 s：72℃×30 s，共34个循环，最后72℃延伸 10 min。GAPDH 用作PCR扩增反应的内对照。

1.7统计分析

2　结果

2.1甲基化特异性PCR结果和HPV16，HPV18的感染情况

40例正常组织没有甲基化，40例宫颈癌组织分别有37例发生甲基化。相应的分别有5例、27例发生了hr-HPV的感染，两项指标统计学均有显著性差异（P＜0.01）（图1，表2）

表1　引物信息和PCR反应条件

图1　HS3ST2甲基化特异性PCR和HPV16，HPV18特异性PCR结果

表2　在子宫颈癌的各阶段中，HS3ST2基因启动子甲基化和hr-HPV感染发生的频率

2.2半定量RT-PCR结果

结果在10例HS3ST2基因启动子甲基化的组织中，HS3ST2基因的mRNA的表达量远远低于10例未甲基化的组织，甲基化阴性组织中的平均吸（P＜0.01，n=3）（图2）。

图2　10例HS3ST2基因启动子甲基化阳性和10例阴性子宫颈组织的mRNA表达情况

3　讨论

宫颈癌的发生是一种有多个病理阶段，多步骤的过程，与hr-HPV感染高度相关，且有随病变严重程度的增加而明显上升的趋势［6］，使其成为癌症机制研究并筛查癌症早期相关分子生物标志的理想模型。由于HSPG广泛分布于细胞表面和细胞外基质，是细胞外基质的主要成分，而且其中的糖胺聚糖是多阴离子化合物，结合Na+、K+，从而吸收水分，其羟基也有亲水性而形成凝胶，从而阻止细菌通过，但不影响小分子化合物的扩散。HS3ST2作为修饰HSPG的重要酶类，其沉默表达可能导致了修饰错乱和信号传导异常。此外，在对非小细胞性肺癌及癌周肺组织，肿瘤及非肿瘤的痰液等标本进行了11个基因的甲基化分析中HS3ST2基因居第一位，且甲基化水平随肿瘤的病理分级升高而升高。显示出很高的相关性［7］。

目前，HS3ST2基因在子宫颈癌发生中的具体分子机制的研究较少，虽然发现了其在许多肿瘤中的特异性和敏感性有应用于早期诊断的潜力，但是HS3ST2基因启动子甲基化与mRNA的表达的关系尚未在子宫颈癌中研究。尤其是，当前将甲基化检测应用于子宫颈癌筛查的主要问题不再是抑癌基因启动子甲基化的特异性不高，而是由于需要结合阴道镜和细胞学来分析甲基化与肿瘤进展的关系，但是这些分析尚存在分歧［8］，而且，当今的早期干预治疗使得甲基化病人的长期随访无法进行，难以统计分析HS3ST2启动子甲基化是否与子宫颈癌的进展恶化直接关系。对此，本文检测了hr-HPV的感染情况，发现40例宫颈癌患与40例正常组织相比均出现较高甲基化和hr-HPV感染率（P＜0.01），提示hr-HPV感染与甲基化存在一定关系，为HS3ST2基因启动子甲基化检测应用于子宫颈癌的早期诊断的可靠性提供相关机制参考和分子水平支持。且甲基化水平高的组织mRNA的表达水平受到了显著抑制（P＜0.01），进一步提示了甲基化在维吾尔族宫颈癌发生发展中的作用。

由上述分析，HS3ST2基因启动子甲基化与新疆维吾尔族妇女子宫颈癌的发生发展高度相关，在HSIL和子宫颈癌中的高特异性和较高的敏感性使其具有补充和改进当前以细胞形态学和HPV检测为主的早期筛查方法，HS3ST2基因启动子甲基化可能是hr-HPV感染所诱导的早期重要的分子改变，具有子宫颈癌早期大规模筛查的潜力。

参考文献

［1］Wu JH，Liang XA，Wu YM，et al.Identification of DNA methylation of SOX9 in cervical cancer using methylated-CpG island recovery assay［J］.Oncol Rep.2013，29（1）:125-132.

［2］Yang HJ，Chin J，Aberrant DNA methylation in cervical carcinogenesis［J］.Cancer.2013，32（1）:42-48.

［3］M.Bernfield，M.Gotte，P.W.Park，et al.Functions of cell surface heparan sulfate proteoglycans［J］.Annu.Rev.Biochem，1999，68:729-777..

［4］Yasuharu Tokuyama.Takao Takahashi，Naoki Okumura，et.al. Aberrant methylation of heparan sulfate glucosamine 3-o-sulfotransferase 2 genes as a biomarker in colorectal cancer［J］.Anticancer research.2010，30:4811-4818.

［5］Elaine H.Lim，Shi Len Ng，Jia Liang li，et al.Cervical dysplasia:Assessing methylation status（Methylight）of CCNA1，DAPK1，HS3ST2，PAX1 and TFPI2 to improve diagnostic accuracy［J］.Gynecologic Oncology，2010，119:225-231.

［6］杜玲.宫颈癌前病变中高危型HPV病毒负荷的临床分析［J］.中国妇幼保健，2013，28:611-612.

［7］Narayan Shivapurkar，Victor Stastny，Makoto Suzuki，et al.Application of a methylation gene panel by quantitative PCR for lung cancers［J］.Cancer Letters.2007，24:756-771.

［8］Nan Yang，Jasper J.H.Eijsink，Aqnes Lendvai，et al.Methylation markers for CCNA1 and C13ORF18 are strongly associated with high-grade cervical intraepithelial neoplasia and cervical cancer in cervical scrapings［J］.Cancer Epidemiology，Biomarkers Prevention，2009，18:3000-3007.

Relationship Between the Promoter Methylation of HS3ST2 Gene and the Cervical Cancer in Xinjiang Uigur Women

YUAN Xin-rong1，ZUO Qiang-qiang1，FENG Qin1，PAN Ze-min2Δ
（1.Department of laboratory， The Second People Hospital of Karamay region， Karamay， Xinjiang 834007 P.R.China， 3.Department of biochemistry， School of medicine， Shihezi university， Shihezi， Xinjiang 832002 P.R.China）

Abstract:Objective：To explore the relationship between the gene promoter methylation of HS3ST2 and the cervical cancer tissues of Xinjiang Uigur women and the feasibility of the early detection and analyze the HS3ST2 gene mRNA expression in methylatiion positive and negative tissues.Methods：Methylation specific PCR（MSP）and HPV16，HPV18 specific PCR were used to detect 40 normal cervix and 40 cervical cancer tissues of Xinjiang Uigur women.The relationship between the methylation and infection was also investigated in 40 cervical cancer tissues.RT-PCR was used to analyze HS3ST2 gene mRNA expression in 10 methylation positive and 10 methylation negative cervical tissues.Results：The methylation frequency of HS3ST2 was 37/40 in cervical cancer.However，HS3ST2 gene promoter methylatiion was not found in 40 normal cervix.The corresponding infection frequency of HPV is 27/40 and 5/40.The HS3ST2 gene mRNA expression level was more decreased in the 10 methylation positive cervical tissues than in the 10 methylation negative cervical tissues.Conclusion：The hypermethylated HS3ST2 may be the critical marker for the cervical lesion that will progress to cervical cancer and has the potential for the early cervical cancer screening.

Keywords:HS3ST2 gene；Xinjiang Uigur women；Gene promoter methylation； HPV； Cervical cancer

*基金项目：兵团青年科技创新资金项目（2012CB018）

作者简介：袁新荣，女，汉族，本科，副主任技师；左强强，男，汉族，山东沂源，硕士生，研究方向：分子遗传学

通讯作者：潘泽民