唐亮，石美宁，王霞，黄旭华，黄深惠，陈小青，胡文娟

（广西壮族自治区蚕业技术推广总站，南宁市 530007）

家蚕核型多角体病毒对两广二号和桂蚕N2创伤感染的差异性分析

唐亮，石美宁，王霞，黄旭华，黄深惠，陈小青，胡文娟

（广西壮族自治区蚕业技术推广总站，南宁市 530007）

以桑蚕抗性品种桂蚕N2和常规品种两广二号为对象，用昆虫针在蚕体表制造创口接种新采集的核型多角体病毒（BmNPV），研究它们感染BmNPV的差异。结果显示两广二号的BmNPV创伤感染半数致死浓度（LC50）为2.46×106PDV/mL，相当于脓病末期蚕血液稀释264倍的值，属于易感品种。而同等条件下桂蚕N2的LC50为2.21×108PDV/mL，相当于稀释不到3倍的值，对核型多角体病毒耐受度显著高于前者，具有很强的抗核型多角体病毒创伤感染的能力。饲养桂蚕N2能显著减少蚕期创伤感染BmNPV的几率。

核型多角体病毒；创伤感染；穿刺；桂蚕N2

家蚕核型多角体病毒（Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus，BmNPV）属杆状病毒科，核型多角体病毒属［1］，是目前广西蚕业生产中危害最为严重的家蚕血液型脓病病原。在蚕业生产中，家蚕感染该病毒后没有很好的治疗手段，主要以预防为主，近些年抗性蚕品种的出现，使得抵御BmNPV有了更多的选择。其中桑蚕新品种桂蚕N2对病毒经口感染的抵抗性高于两广二号近1 000倍［2］，对防范农民朋友养蚕中暴发血液型脓病有十分积极的作用。BmNPV以食下传染为主，但也可通过伤口感染。部分蚕农为了追求更大收益，蚕头密度往往偏高，易发生相互抓伤［3，4］，增大经伤口感染BmNPV的几率。目前，已有研究显示增加蚕头密度能提高两广二号的血液型脓病发病率［3，4］，但未见BmNPV经创伤感染抗性蚕品种的报道，本文以抗性品种桂蚕N2和常规品种两广二号为对象，研究它们伤口感染BmNPV的差异。

1 材料与方法

1.1 供试蚕品种

原种：932×芙蓉；一代杂交种：两广二号正交、桂蚕N2正交，均由广西蚕业技术推广总站提供。

1.2 供试病原

家蚕核型多角体病毒病毒株为广西蚕业技术推广总站桑蚕病虫害研究室保存。

1.3 用具

0#昆虫针，血球计数板（25大格×16小格），尼康E100显微镜，尼康体视显微镜，超净工作台。

1.4 试验方法：

1.4.1 制备新鲜BmNPV病毒及其梯度浓度 取核型多角体病毒株1×107个多角体/mL，均匀涂抹于桑叶表面，添食932×芙蓉4龄起蚕12 h之后转正常桑叶饲养，经过约84 h，蚕体表现出行动狂躁、环节和节间膜肿胀、蚕体呈乳白色，选取有以上特征的活蚕，用75%的酒精消毒蚕体，晾干后剪尾角取血液，冷藏备用（新制病毒在6 h内使用）。本实验主要模拟蚕创伤感染，使用BmNPV病蚕全血进行穿刺，鉴于细胞释放型病毒（cell-released virus，CRV）定量步骤复杂且准确度一般，本文采用对多角体衍生病毒粒子（polyhedronderived virus，PDV）定量辅助评估血液中病毒粒子的值。即在显微镜下（600倍）使用血球计数器确定血液样品中PDV的浓度，并用无菌水（0.9%生理盐水）以10倍稀释比例制备100、10-1、10-2、10-3的PDV梯度稀释液，置于4 ℃保存备用。

1.4.2 模拟创伤感染 使用昆虫针穿刺蚕体，人为制造较小创伤接种病毒模拟蚕创伤感染。操作过程在无菌操作台进行，为避免伤口感染细菌，穿刺前用75%的酒精消毒蚕体并晾干，穿刺节间膜处需拉伸充分晾干以避免残留酒精对出芽型病毒粒子产生不良影响［1］。用0#昆虫针粘取病毒液穿刺蚕第一、二腹足环节的节间膜，刺入深度约2 mm，每次穿刺后昆虫针在酒精灯火焰上加热灭菌备用。

1.4.3 穿刺感染半数致死浓度（LC50）测定 取两广二号正交5龄起蚕，每30头为一区，置于4.4 L （29.3 cm×19.3 cm×9.5 cm）塑料盒保鲜盒中饲养，分别穿刺接种以上制备的不同浓度病毒液，每种浓度3个重复，以无菌水作为空白对照。桂蚕N2正交的实验方法同两广二号正交。试验蚕在穿刺后72 h内死亡，不计入有效感染死亡数，穿刺后72 h至168 h期间死亡及未上蔟的蚕均通过显微镜检测确认感染病毒，计为有效感染死亡数，否则记为未感染蚕数。调查各区家蚕发生血液型脓病数量，采用Read-Muench法计算两个蚕品种半数致死浓度（LC50）［5］。

1.4.4 BmNPV发病率计算方法

BmNPV发病率=（穿刺试验累积平均发病数量-空白对照累积平均发病数量）/（30头-72 h内平均死亡数量-空白对照累积平均发病数量）×100%。

2 实验结果

2.1 新鲜血液中家蚕核型多角体病毒含量

收集932×芙蓉添食NPV感染发病后的活蚕血液进行定量，确定血液中多角体个数为6.5×108个多角体/mL，然后按照10倍的稀释梯度，制备PDV 4个浓度梯度，分别为6.5×108、6.5×107、6.5×106、6.5×105PDV/mL，用于穿刺试验。

2.2 穿刺感染结果

使用0#昆虫针穿刺5龄起蚕的第一、二腹足节间膜（图1-A），且穿刺伤口将显著大于腹足钩爪单次造成的伤口（图1-B），为降低外界细菌对实验的干扰采取蚕体消毒处理，两个蚕品种无菌水对照穿刺组均未见BmNPV发病前死亡蚕（72 h内死亡，主要为细菌感染后败血症死亡），实验重复性好。但两个蚕品种接种病毒时均出现了发病前死亡现象，两广二号正交品种接种浓度由高至低平均每区分别为2.3头、2头、1.3头、0头，而桂蚕N2正交品种只有最高和次高两个浓度接种时出现平均每区0.7头、0.3头死亡（表1），表现出了更好抵御细菌侵染的能力。使用SPAA19.0统计软件One-wayANOVA进行显著差异分析，两个品种在相同浓度下差异达到显著水平（P＜0.05），其中高浓度和次高浓度达极显著差异（p＜0.01）。

图1 家蚕体部结构放大图

2.3 半数致死浓度（LC50）测定试验

统计数据显示（表1），两广二号发病时间集中在96～120 h，而相同浓度接种情况下桂蚕N2的发病时间集中在120～144 h，较前者延迟24 h。累计发病情况，两广二号接种6.5×107PDV/mL以上浓度累计发病率已达100%，利用Read-Muench法计算得到半数致死浓度为2.46×106PDV/mL，相当于脓病发病末期活蚕血液稀释264倍的病毒含量；同等实验条件下桂蚕N2接种6.5×108PDV/mL浓度的病毒后累计发病率仅为62.9%，其半数致死浓度为2.21×108PDV/mL为脓病发病末期活蚕血液稀释约3倍的值，即其抗病毒能力比两广二号高近90倍。试验显示桂蚕N2正交有很好抵御经创伤感染核型多角体病毒的能力，可显著减少蚕期创伤感染BmNPV的几率。

表1 穿刺试验数据统计

3 讨论

家蚕腹足底部有一定数量的钩爪（图1-C、图1-D、图1-E），若饲养密度大，蚕在爬行过程中容易相互抓伤皮肤，这一现象更容易发生在起蚕表皮还未完全硬化的阶段。饲养密度高容易引起蚕体表创伤，增加感染NPV的几率［3，4］，两广二号是常用的强健性蚕品种，在本试验中显示其外伤感染BmNPV的半数致死浓度为2.46×106PDV/mL，相当于实验中取材的脓病末期活蚕血液稀释264倍的值，属于易感品种。桂蚕N2半致死浓度比两广二号高90倍，达2.21×108PDV/mL，使用病蚕血液原液（病毒含量为6.5×108PDV/mL）穿刺桂蚕N2的发病率只能达到62.9%，显示其对BmNPV有很强的抑制或清除能力，具有更好的抗NPV病毒性状。

实验显示穿刺浓度高时，出现少量非病毒病致死情况，症状为细菌性败血病，同等条件下两广二号发生数量均显著高于桂蚕N2，后者抗细菌感染呈现出整体好于前者的趋势。值得注意的是桂蚕N2不仅有较强的抗核型多角体病毒能力，而且对细菌感染也有一定的抗性，这种多抗现象也曾有学者报道过，如张元能等［6］研究发现基础品种越五、钛金均具备抗多种病原微生物的能力。

核型多角体病毒在血体腔内有两种时相，细胞释放型病毒（cell-released virus，CRV）和多角体衍生病毒粒子（polyhedron-derived virus，PDV），由于病毒大小的差异，对它们的定量方式也存在很大不同。CRV病毒粒子太小，定量PCR是常用的检测手段，缺点是步骤繁琐、耗时长且定量准确性一般；而PDV因其有多角体蛋白包裹保护，形态较大可在常规显微镜下直接观察和定量，操作方便定量迅速。本文采用对其中一种病毒粒子定量间接评估两种病毒粒子总量的定量策略，即使用显微镜（600倍）对PDV定量来评估病毒粒子总量（PDV+CRV），方法操作简便，且实验重现度高，能满足本实验需求。但这一方法也有一定的弊端，即几乎仅在血体腔有强传染能力的CRV［1，7］，未计入实验数据，导致所测的半致死浓度数值应比实际值低。

试验为减小细菌对试验重复性的影响，本文选择BmNPV感染发病但未死亡或破裂脓病末期病蚕的血液进行穿刺，其病毒粒子的含量会低于正常发病死亡脓蚕所释放的血液中病毒含量且细菌含量会升高，因此在实际养蚕过程中，脓蚕体液释放后通过创伤造成的BmNPV二次感染的值会比本文试验数值高。

桂蚕N2抗BmNPV创伤感染及抑制细菌感染的能力得以验证，能有效降低血液型脓病的感染发病率，这一结果与目前桂蚕N2品种推广应用的实际情况相似［8］，在高温季节血液型脓病发病率比两广二号低11.53个百分点，死笼率也低很多。由此可见，桂蚕N2对BmNPV食下、创伤两个感染途径均具有很强抵抗力，是很好的实用性抗病品种。大力推广桂蚕N2将能显著减少蚕期感染BmNPV的几率，对控制新、老蚕区血液型脓病的爆发，提高蚕农收益有积极的意义。

［1］ 吕鸿声.昆虫病毒分子生物学［M］.北京：中国农业科技出版社.1998：149-151.

［2］ 石美宁，闭立辉，顾家栋，等.家蚕抗血液型脓病新品种桂蚕N2的选育［J］.广西蚕业.2012，49（4）：1-12.

［3］ 韦秉兴，邱海洪，冯健玲，等.广西家蚕血液型脓病蚕座内传染的研究［J］.安徽农业科学，2008，36（10）：4149-4150+4157.

［4］ 邱洪海.广西家蚕血液型脓病及生物药物防治的研究［D］.南宁：广西大学.2008

［5］ 浙江大学.家蚕病理学［M］.北京：中国农业出版社，2000：242.

［6］ 张远能，刘仕贤，霍用梅，等.若干家蚕品种对六种主要蚕病的抗性鉴定［J］.蚕业科学.1982，8：94-97.

［7］ Toru Arakawa，Manabu Kamimura，Yoji Furuta，et. Al. Peroral infection of nuclear polyhedrosis virus budded particles in the host，Bombyx mori L.，enabled by an optical brightener，Tinopal UNPA-GX［J］.Journal of Virological Methods.2000，88：145-152.

［8］ 石美宁，唐亮，黄红燕，等.桑蚕新品种“桂蚕N2”的推广应用初报［J］.广西蚕业.2015，52（3）：27-31.

S884；

A；

1006-1657（2016）03-0017-4

2016-05-18；

2016-06-05

信息］唐 亮（1984—），男，研究生，农艺师，现从事家蚕抗病育种与病虫害防控技术研究工作。E-mail：ty008tl@163.com