余 慧，罗金燕，吕 进，赵玉强，陈 磊，姚红梅

（1.上海市农业技术推广服务中心，上海 201103；2.湖州市植物保护植物检疫站，浙江湖州 313000）



基于种特异性PCR技术快速鉴定葡萄根瘤蚜

余 慧1，罗金燕1，吕 进2，赵玉强1，陈 磊1，姚红梅1

（1.上海市农业技术推广服务中心，上海 201103；2.湖州市植物保护植物检疫站，浙江湖州 313000）

摘 要：葡萄根瘤蚜是一种严重威胁葡萄生产的入侵性害虫。由于蚜虫类害虫种类多、体型微小、形态相似，难以快速准确地进行鉴别。文章以葡萄根瘤蚜为研究对象，以常见果树蚜虫为参照，采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ基因的种特异性PCR方法，研究葡萄根瘤蚜的快速鉴定技术。利用mtDNACOI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198获得葡萄根瘤蚜及其他果树常见蚜虫的COI序列，根据测序结果设计1对种特异性SS-COI引物（VitF269/VitR557），扩增片段大小为308 bp。种特异性检验结果显示，该对引物仅对葡萄根瘤蚜的mtDNACOI基因具有扩增效果，其他5种蚜虫均没有扩增条带。

关键词：葡萄根瘤蚜；种特异性引物；快速鉴定；PCR

文献著录格式:余慧，罗金燕，吕进，等.基于种特异性PCR技术快速鉴定葡萄根瘤蚜［J］.浙江农业科学，2016，57（6）: 901-904.

葡萄根瘤蚜（ViteusvitifoliiFitch）隶属球蚜总科（Adelgoidea）根瘤蚜科（Phylloxeridae）葡萄根瘤蚜属（ViteusShimer），既是我国农业植物检疫性有害生物又是进境植物检疫性有害生物［1］。该虫原产于北美洲西部［2］。19世纪50年代该虫随葡萄苗木传入欧洲并迅速扩散，毁灭了该地区大部分葡萄园［3］。葡萄根瘤蚜于1935年在我国山东烟台市首次发现［4］，随后在辽宁大连、盖县、丹东、辽阳、昌图、兴城和陕西武功及台湾地区均发现了葡萄根瘤蚜为害［5-7］，后经砍伐毁园后，30余年中没有再见其发生报道［8］。2005年上海市首次发现葡萄根瘤蚜危害［9］，2006年湖南怀化亦发现葡萄根瘤蚜危害［10］。

葡萄根瘤蚜以卵和一龄若虫在葡萄根部越冬或以越冬卵在较老的藤及主根的树皮下越冬［3，11］。葡萄根瘤蚜一般情况下以无翅根瘤蚜的形式存在，只在7—10月份才有12%～35%的个体发育成有翅蚜，爬出土壤进行活动危害葡萄，有翅蚜的出现加速了葡萄根瘤蚜的传播［12］。从近年来上海市监测结果来看，通常同一果园内种植多种果树，同一种蚜虫可危害多种果树，如田间调查发现桃粉大尾蚜既可危害柑橘、桃又可危害葡萄。爬出土壤活动的有翅葡萄根瘤蚜与其他在葡萄树上危害的蚜虫均具有体型微小、形态相似等难以鉴定的特点。因此，快速、准确鉴定葡萄根瘤蚜的方法能有效提高田间葡萄及其他果树蚜虫的监测效率。

近年来，越来越多的分子生物学技术被运用于昆虫鉴定［13-14］。葡萄根瘤蚜的分子生物学鉴定也在快速开展。2008年，Herbert等［15］设计并筛选了ITS2序列引物鉴定葡萄根瘤蚜，其筛选的DNA探针能有效地从土壤中鉴定出葡萄根瘤蚜；2011年，Bruce等［16］通过DNA试验从田间土壤中鉴定出葡萄根瘤蚜；2015年，Zhu等［17］通过Herbert等设计的引物对DVIT-F和DVIT-R从葡萄根和危害葡萄的根结线虫中鉴定出葡萄根瘤蚜。上述技术是针对土壤及葡萄根中葡萄根瘤蚜的快速鉴定，尚未发现从其他蚜虫尤其是危害葡萄的蚜虫中鉴定出葡萄根瘤蚜的报道。葡萄根瘤蚜与其他果树蚜虫快速鉴定方法的缺乏将严重影响果树蚜虫田间监测调查的时效性。因此，迫切需要葡萄根瘤蚜与其他果树蚜虫的快速鉴定识别技术。

种特异性PCR（species-specific PCR，SSPCR）技术，在设计目标物种引物时必须充分考虑引物的特异性，在扩增未知模板时能够根据目标片段条带的有无把目标种类与其他种类鉴别开来。本研究采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基I基因（mtDNACOI）的种特异性PCR技术，建立葡萄根瘤蚜的快速检测技术，准确快速地完成葡萄根瘤蚜的鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所使用的蚜虫均为2014—2015年上海植检站在果树田间调查监测中采集，具体采集信息如表1所示，所有标本浸泡于无水乙醇，-20℃保存备用。

表1　用于本研究的蚜虫种类采集信息

1.2 DNA提取

采用Qiagen公司的Blood &TissueKitDNA提取试剂盒提取蚜虫总DNA，提取方法按照试剂盒说明书操作。提取的蚜虫总DNA放入-20℃保存备用。

1.3 COI基因5′端序列扩增

以葡萄根瘤蚜及其他5种常见果树蚜虫的DNA为模板，采用mtDNACOI基因通用型引物LCO-1490（5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTG-3′）与HCO-2198（5′-TAAACTTCAGGGTGACCAAA AAATCA-3′）进行PCR扩增［18］。PCR反应体系为30 μL，模板DNA1.0 μL，10×buffer3.0 μL，Mg2 +（25 mmol·L-1）3.0 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）3.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，TaqDNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.2 μL，ddH2O 17.8 μL。PCR反应条件为94℃3 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃1 min，35个循环；72℃延伸10 min。

取6 μL PCR扩增产物，在含有染色剂GoldView（0.5 μg·mL-1）的1.0%琼脂糖凝胶上电泳分离，用GelDocUniversalHoodⅡ型凝胶成像系统（Bio-Rad Laboratories）分析电泳结果。电泳分析质量合格的PCR产物送生工生物工程（上海）股份有限公司进行双向测序。

1.4 葡萄根瘤蚜特异性SS-COI引物的设计

根据1.3节中的测序结果，运用Oligo6.0设计1对葡萄根瘤蚜特异性SS-COI引物。上游引物VitF269: 5′-CCCTCTTTAATAATAATACTA-3′，下游引物VitR557: 5′-TATTGTAATAGCACCAGT-3′，送生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 葡萄根瘤蚜特异性SS-COI引物种特异性检测

分别以葡萄根瘤蚜、桃蚜、桃粉大尾蚜、棉蚜、绣线菊蚜和莲缢管蚜6种蚜虫的单头成虫DNA为模板，以葡萄根瘤蚜为阳性对照，检验葡萄根瘤蚜SS-COI引物VitF269/VitR557的特异性。PCR反应体系为30 μL，模板DNA1.0 μL，10× buffer3.0 μL，Mg2 +（25 mmol·L-1）3.0 μL，dNTP（2.5 mmol·L-1）3.0 μL，上下游引物（10 μmol·L-1）各1.0 μL，TaqDNA聚合酶（2.5 U·μL-1）0.2 μL，ddH2O17.8 μL。反应条件为94℃3 min；94℃30 s，48℃30 s，72℃1 min，35个循环；72℃延伸10 min。扩增产物检测方法同1.3节。

1.6 葡萄根瘤蚜特异性SS-COI引物种灵敏度检验

利用核酸蛋白分析仪测试提取的葡萄根瘤蚜DNA模板的浓度。将葡萄根瘤蚜DNA模板按10-1，10-2，10-3和10-4倍梯度稀释，然后使用种特异性引物VitF269和VitR557进行PCR扩增，来验证检测方法的灵敏度。

2 结果与分析

2.1 蚜虫类昆虫COI基因5′端序列的扩增及SSCOI标记分析

以葡萄根瘤蚜及其他5种常见果树蚜虫DNA为模板，以mtDNACOI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198进行PCR扩增。电泳检测结果显示，6种蚜虫均能扩增出一条清晰的靶标片段（图1），测序结果显示，该片段长度约为680 bp。

图1　COI基因通用型引物LCO-1490/HCO-2198的扩增效果

2.2 葡萄根瘤蚜SS-COI引物的种特异性检验

以葡萄根瘤蚜及其他5种常见蚜虫类害虫DNA为模板，以葡萄根瘤蚜特异性SS-COI引物VitF269/VitR557进行PCR扩增。结果显示，只有葡萄根瘤蚜的DNA能扩增出条带，其扩增片段大小为308 bp，表明该对引物为葡萄根瘤蚜的特异性引物（图2）。测序结果表明，该序列与NCBI数据库中的葡萄根瘤蚜序列具有100%的一致性。

图2　种特异性SS-COI引物VitF269/VitR557的扩增效果

2.3 葡萄根瘤蚜SS-COI引物的灵敏度检验

核酸蛋白分析仪测试结果表明，提取的葡萄根瘤蚜DNA模板的浓度为17.5 ng·μL-1。取不同浓度的DNA模板进行最低检出阈值的测定，随着模板浓度的降低，扩增出的条带逐渐减弱，在稀释10-3倍后仍有明显条带，说明该方法具有较高的灵敏度（图3）。

图3　引物VitF269/VitR557的灵敏度验证

3 讨论

葡萄根瘤蚜个体微小，为害环境隐蔽，易随寄主葡萄苗木的远距离运输而传播扩散，传统的形态学鉴定无法满足快速识别和有效阻截的基本需求。本研究采用基于mtDNACOI基因的SS-COI标记技术，研发出了葡萄根瘤蚜特异性引物VitF269/VitR557及其快速检测方法。该引物特异性强，仅对葡萄根瘤蚜有扩增效果，对田间其他常见的果树蚜虫如桃粉大尾蚜、桃蚜、棉蚜、莲缢管蚜和绣线菊蚜不具扩增能力。同时，该技术体系具有较高的灵敏度，能检测到的DNA模板浓度可低至17.5× 10-3ng·μL-1。此外，数据库同源性比对分析结果显示，没有任何一种昆虫的DNA序列与葡萄根瘤蚜特有的308 bp片段序列完全一致，表明该检测技术体系完全可以用于田间监测和葡萄苗木调运中对葡萄根瘤蚜的快速检测。

本研究研发的葡萄根瘤蚜特异性SS-COI引物VitF269/VitR557及其快速检测技术体系是对葡萄根瘤蚜形态鉴定识别方法的补充，提高了检测效率，在葡萄根瘤蚜监测检测中具有较好的应用价值。由于果树蚜虫类昆虫种类较多，一些种类本研究并未涉及，SS-COI引物的特异性有待进一步验证。

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（责任编辑：侯春晓）

中图分类号：S436.631.2+1

文献标志码：A

文章编号：0528-9017（2016）06-0901-03

DOI：10.16178/j.issn.0528-9017.20160634

收稿日期:2016-01-20

作者简介:余 慧（1982—），女，河南驻马店人，农艺师，硕士，从事植物检疫工作，E-mail: yuhui-lucky@163.com。

通信作者:姚红梅，E-mail: yaohm88@126.com。