杜春玲　徐　侃　闵智慧　苏孝琼　董　年　白丰玺　陈智鸿△

(1复旦大学附属中山医院呼吸科　上海　200032;2复旦大学附属中山医院青浦分院呼吸科　上海　201700;3复旦大学附属中山医院老年科,4实验研究中心　上海　200032)



流式细胞磁珠微阵列法检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义

杜春玲1,2徐侃3闵智慧4苏孝琼1董年1白丰玺1陈智鸿1△

(1复旦大学附属中山医院呼吸科上海200032;2复旦大学附属中山医院青浦分院呼吸科上海201700;3复旦大学附属中山医院老年科,4实验研究中心上海200032)

【摘要】目的探讨流式细胞磁珠微阵列法(cytometric beads array,CBA)检测血清中细胞因子水平在稳定期和急性加重期哮喘中的意义。方法纳入慢性持续期哮喘40例,急性发作期哮喘22例,健康人 18例。抽取外周血2 mL,采用CAB法检测外周血清中细胞因子水平,并分析各细胞因子特征及与临床数据的相关性。全自动血细胞及生化仪检测血常规,C反应蛋白和降钙素原。结果定制含7种细胞因子微球(分别为IL-5,IL-6,IL-10,IL-13,IL-17,TNF-α,IFN-γ)的CBA试剂盒。与健康人相比,7种细胞因子在慢性持续期哮喘无明显改变。急性发作期哮喘细胞因子升高分为5种亚群,分别为IL-6升高型(22.8%)、IL-6/TNF-α双高型(13.6%)、IL-5升高型(31.8%)、IL-17升高型(占13.6%)及细胞因子正常型(占18.2%)。其中,IL-6、TNF-α明显升高,较健康人分别升高了6.28～12倍和17.3倍。IL-6升高型、IL-6/TNF-α升高型与白细胞及C反应蛋白呈正相关(R2=0.63,R2=0.67;P<0.05)。结论CBA法可快速检测哮喘血清标本的多种细胞因子水平,细胞因子在慢性持续期无明显升高,但IL-6、TNF-α、WBC和CRP的综合指标有助于判断由细菌感染诱发的急性加重,并快速指导抗生素的使用。

【关键词】细胞因子;哮喘;流式细胞磁珠微阵列法

*This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(81270078,81470211).

哮喘是气道对无害化过敏原的过度反应。CD4+T 淋巴细胞分化失衡(Th2>Th1)是大部分哮喘患者气道炎症持续存在的主要原因。但临床中的哮喘又非常复杂,如非过敏性哮喘、晚发型哮喘、哮喘伴有慢阻肺、肥胖型哮喘等,即哮喘的致病过程除了传统的T淋巴细胞比例失衡,还可能有多种炎性细胞如嗜酸性细胞、肥大细胞、中性粒细胞等参与。细胞因子是联系各种细胞间的信号分子,包括免疫细胞间，免疫细胞和结构细胞间。因此,细胞因子水平在哮喘致病机制、与临床特征的相关性、临床应用价值等方面备受关注。尽管气道/肺局部的细胞因子最为准确,如气道黏膜活检、支气管肺泡灌洗等,但哮喘为良性疾病,患者多不愿接受有创检查,所以通过外周血清/血浆,或外周血单个核细胞来反应细胞因子水平比较常用,但国际上对其利用价值尚存在争议[1-2]。

我们采用流式细胞磁珠微阵列法(cytometric beads array,CBA)检测稳定期哮喘和急性发作期哮喘外周血清中细胞因子水平,试图分析细胞因子在各期哮喘中的特征,并结合临床数据进行相关性分析。

资 料 和 方 法

研究对象第一部分研究对象为2014年6月至9月期间在复旦大学附属中山医院门诊就诊的稳定期哮喘患者。纳入标准:需符合2014年全球哮喘防治创议(Global Initiative for Asthma,GINA)的诊断标准;年龄18～70岁;轻度持续和中度持续支气管哮喘患者。排除标准:慢性阻塞性肺疾病;社区获得性肺炎,支气管扩张,肺结核,严重的慢性心脏、肝、肾病,糖尿病、结缔组织病、妊娠等。共入选轻度持续性哮喘患者20例,中度持续性哮喘患者20例,健康人18例。

第二部分研究对象为2014年10月至2015年1月期间在复旦大学附属中山医院门急诊就诊的急性发作期哮喘患者。纳入标准:年龄18～70岁;符合2014年GINA关于哮喘急性发作的诊断标准,包括气喘、咳嗽或胸闷症状突然发生;或原有症状急剧加重,常有呼吸困难,以呼气流量降低为特征。排除标准:稳定期哮喘,哮喘患者由于其他疾病导致的呼吸困难如急性社区获得性肺炎、肺栓塞、气胸,伴有严重的的慢性心脏、肝、肾病,糖尿病、结缔组织病等。共纳入急性发作期哮喘22例,健康人18例。

该临床研究通过复旦大学附属中山医院伦理委员会批准(批准号为A-026-1.1),实施时均告知患者研究目的、获益和潜在风险,并签署知情同意书。

主要试剂和仪器CBA人可溶性蛋白主缓冲试剂盒 (美国 BD公司):主要包含检测稀释液30 mL,捕获微球稀释液5 mL,检测稀释液5 mL,血清的捕获稀释液5 mL,清洗缓冲液 130 mL,标准微球A1 0.25 mL,标准微球A9 0.25 mL,标准微球F1 1 mL,标准微球F9 0.25 mL,PE标记的标准微球F1 0.25 mL,PE标记阳性对照 0.5 mL。流式检测仪器为Aria Ⅱ(美国BD Biosciences公司)。CBA分析软件为FCAPArray Version 3.0。血常规采用Sysmex 全自动血液分析仪(XE 2100),C反应蛋白和降钙素原(procalcitonin,PCT)采用日立全自动生化分析仪(日立7600)检测。

实验方法

CBA试剂盒细胞因子标准曲线制备将细胞因子标准品(2 500 pg/mL)置于15 mL离心管中。标记8个流式管,分别为1∶2,1∶4,1∶8,1∶16,1∶32,1∶64,1∶128,1∶256,检测稀释液为阴性对照。以上每管先加入300μL检测稀释液。从原液管开始对倍稀释即从原液管中吸300μL到1∶2管中混匀,再从1∶2管中吸300μL加入 1∶4管,以此类推。

混合的捕获微球制备每种捕获微球取出10μL,根据要检测总样本数,每种捕获微球吸取的体积为:10μL×样本数。混合7种捕获微球,200×g,离心5 min,弃上清,重悬于血清增强液中,避光、室温静置30 min。上述每管中加入50μL混合的捕获微球,室温孵育1 h,再加入50μL PE标记的检测抗体,室温孵育2 h。加入1 mL 清洗缓冲液,200×g,离心5 min。吸去上清,加入300μL清洗缓冲液重悬。留待上机检测。

CBA试剂盒血清样本中7种细胞因子浓度的检测加入50μL待测样品到流式管中,如上述步骤制备7种捕获微球的混合液,每管加入50μL混合的捕获微球,轻轻吹打。室温孵育1 h。加入50μL混合后的PE标记检测抗体,轻轻吹打,室温孵育2 h。加入1 mL 清洗缓冲液,200×g,离心5 min。弃上清,加入300μL清洗缓冲液重悬。留待上机检测。

全血及血清生化指标检测每例患者抽取2 mL血液,其中1 mL为EDTA抗凝血,经Sysmex流水线,通过 XE2100全自动血液分析仪,得到全血细胞各种数据。另1 mL离心得到上清,留取100μL做CBA检测,其余经德赛诊断试剂盒,并经日立7600全自动生化仪检测C反应蛋白。经罗氏诊断试剂盒,并经Cobase 602全自动生化免疫分析仪检测降钙素原。

结果

人口学资料本研究共纳入稳定期哮喘患者共40例,其中轻度持续哮喘20例,中持续哮喘20例,平均年龄为42岁,男女比例为1∶1.5。健康人 18例,平均年龄为38岁,男女比例为1∶1。研究纳入的哮喘急性发作期患者为22例,平均年龄为45岁,男女比例为1.2∶1。健康对照同前。

稳定期哮喘患者血清中细胞因子水平本研究共定制了7种细胞因子检测微球,分别为IL-5、IL-6、IL-10、IL-13、IL-17、TNF-α和IFN-γ。其中IL-6主要为单核细胞和巨噬细胞分泌,在急性感染或组织损伤时大量释放;TNF-α为细胞毒素,在感染、休克或肿瘤性疾病中升高。本研究中稳定期哮喘患者(轻度持续,中度持续)血清中IL-6水平分别为:29.09 pg/mL,28.37 pg/mL (vs.健康人,P=0.203);TNF-α分别为(轻度持续,中度持续):12.36 pg/mL,11.68 pg/mL (vs.健康人,P=0.167)。IL-5,IL-13主要为Th2型淋巴细胞分泌,与过敏性哮喘发病密切相关。通过检测发现稳定期哮喘与健康人比较无显著差异。其中IL-5血清浓度在轻、中度持续性哮喘分别为10.75 pg/mL和11.99 pg/mL (vs.健康人,P=0.401),IL-13血清浓度在轻、中度持续性哮喘分别为2.42 pg/mL和2.72 pg/mL (vs.健康人,P=0.438);IL-17和IFN-γ是胞外菌感染时释放的细胞因子,在迟发型免疫反应中可进一步趋化单核细胞和吞噬细胞到炎症部位。稳定期哮喘血清中IL-17水平分别为30.82 pg/mL和29.16 pg/mL (vs.健康人,P=0.097);IFN-γ水平分别为4.67 pg/mL和4.05 pg/mL (vs.健康人,P=0.103)。IL-10为抑制性细胞因子,本研究中稳定期哮喘血清IL-10水平与健康人无明显差异,在轻、中度持续性哮喘中分别为12.87 pg/mL,13.96 pg/mL (vs.健康人,P=0.078)(表1)。说明检测稳定期哮喘外周血中细胞因子水平不能反应气道炎症的类型和严重程度。

表1　稳定期哮喘患者血清中细胞因子水平

哮喘急性发作期血清中细胞因子水平变化共纳入哮喘急性发作期患者22例,根据2014年GINA的诊断标准和2013中国支气管哮喘防治指南,判断急性发作的严重程度。其中轻度急性发作 4例,中度急性发作 10例,重度急性发作8例。每例患者抽取外周血2 mL,血清保存于-80 ℃冰箱,待统一检测。若不对患者进行细分,计算所有急性发作哮喘患者外周血中细胞因子平均水平,发现仅IL-6和TNF-α明显升高,分别为(71.79±21.8) pg/mL(vs.健康人,P=0.022)和(84.33±20.8)pg/mL(vs.健康人,P=0.017),其数据变异度也较大。其余细胞因子水平与健康人无明显差异(图1)。仔细分析原始数据发现,急性发作期哮喘细胞因子升高的模式不尽相同,若定义急性期细胞因子的绝对值较健康人升高2倍及以上为明显增高,可将患者分为5种细胞因子亚群,分别为IL-6升高型5例(22.8%,5/22),IL-6/TNF-α双高型3例(13.6%,3/22),IL-5升高型7例(31.8%,7/22),IL-17升高型3例(13.6%,3/22),细胞因子正常型4例(18.2%,4/22)。

哮喘急性发作期患者其细胞因子型与临床特征的关系对稳定期哮喘血清中细胞因子水平的筛查发现,稳定期炎症聚集在气道局部,全身细胞因子水平不高(基本与健康人相似)。而哮喘急性发作期,发现了5种类型的细胞因子群,且IL-6升高型和IL-6/TNF-α升高型细胞因子水平大幅度升高,IL-6升高6.28～12倍(较基线水平),TNF-α升高17.3倍(较基线水平)。而IL-5升高型和IL-17升高型轻度升高,其中IL-5升高3倍(较基线水平),

Compared with healthy subjects,(1)P<0.05.

图1CBA法检测哮喘急性发作期和健康人血清中细胞因子水平

Fig 1Serum cytokine concentration for acute exacerbation asthma and healthy subjects measured by CBA method

IL-17升高2.01倍(较基线水平)(图2)。哮喘急性发作诱发因素较多,如感染、过敏原、冷空气、药物等,临床上通常采用症状、外周血白细胞、CRP及降钙素原(PCT)等来判断是否由感染诱发。我们发现IL-6升高型、IL-6/TNF-α升高型与白细胞升高及CRP升高相关性较好。两型白细胞总数均值为:(10.4～11.5)×109/L,两者的相关系数R=0.63 (P<0.05);而CRP均值为21.6～41.6 mg/L,两者的相关系数R=0.67(P<0.05)。细胞因子与PCT未见明显相关性(表2,图3)。说明IL-6或TNF-α可反映机体急性感染的状况。而IL-5升高型,IL-17升高型及细胞因子正常型的外周血白细胞及CRP均无明显升高,经统计分析无相关性(图3)。说明这群患者的哮喘急性发作并非感染诱发。

Compared with healthy subjects,(1)P<0.01;(2)P<0.05.

图2　CBA法检测哮喘急性期血清中细胞因子水平并划分亚群

Compared with healthy subjeots,(1)P<0.05;(2)P<0.01.

气道慢性炎症是所有类型哮喘的共同特征,也是其临床症状和气道高反应性的基础。已知各种炎性细胞包括T淋巴细胞、嗜酸性细胞、肥大细胞、嗜碱性细胞、中性粒细胞和单核细胞等均参与了哮喘复杂气道炎症的发生发展过程,由炎症细胞释放的“细胞因子”一直备受关注。细胞因子的临床研究取材主要为两大部分,一部分来自哮喘患者外周血的单个核细胞(peripheral blood monouclear cells,PBMC),另一部分来自于患者血清/血浆。Leonard等[3]研究了18例过敏型哮喘,6例其他过敏症患者和7例健康人,患者外周血PBMC与屋尘螨、IL-2共孵育,检测发现:过敏性哮喘和患其他过敏症的患者,其上清IL-4分泌量大增,而IFN-γ的分泌量低于其他过敏症患者,且IFN-γ的量与症状严重度成反比。为比较儿童哮喘患者对常年性过敏原和季节性过敏原的反应性。Rudin等[4]共纳入了20例尘螨过敏的哮喘、24例黑麦草过敏的哮喘,20例对两者均过敏的哮喘及20例健康人,外周血PBMC分别用不同的过敏原刺激,发现对常年性过敏原(尘螨)过敏者能诱导分泌Th2型细胞因子(如IL-4、IL-5、IL-9、IL-13等),如仅对季节性过敏原(如黑麦草)过敏者,则不能刺激PBMC分泌Th2型细胞因子。当然也有研究者发现外周血PBMC对过敏原的反应性不能鉴别哮喘的类别及疾病的状态[5]。血清/血浆中细胞因子研究发现:哮喘急性发作期和缓解期的IL-4水平明显增高(与健康人比较),布地奈德雾化吸入后,血清中IFN-γ、IL-2水平增高,而IL-4、IL-10显著降低[6-7]。在一项对哮喘不同时期血清中IL-4、IL-16和内皮素受体1(ET-1)的研究中发现,血清IL-4含量在哮喘急性发作期均高于慢性持续期、缓解期及正常对照。而IL-16和ET-1含量在哮喘急性发作期、慢性持续期均明显高于缓解期和正常对照。提示以上3种炎性因子均参与了哮喘的发生和发展,动态测定IL-4、IL-16和ET-1对于评价哮喘的病情及指导治疗有一定价值[8-9]。由于细胞因子在哮喘亚类判断、病情评估和指导治疗方面尚存在争议,我们选取了复旦大学附属中山医院门、急诊就诊的稳定期哮喘40例,急性发作期哮喘22例和健康对照18例纳入研究。虽然哮喘是以T淋巴细胞、嗜酸性细胞,肥大细胞为主的气道慢性炎症,在哮喘的整个疾病过程中一旦遭遇感染还有中性粒细胞、单核巨噬细胞等参与[10]。因此在细胞因子的选择上,我们定制了Th2型细胞因子IL-5,IL-13; Th1型细胞因子IFN-γ;Th17型细胞因子IL-17;单核细胞/中性粒细胞释放的细胞因子IL-6,TNF-α;抑制性细胞因子IL-10,并观察各细胞因子在稳定期哮喘和哮喘急性发作期的水平变化。

本研究包含两组哮喘患者,一组为慢性持续期患者,共40例,其血清细胞因子水平未见升高。Nadi等[11]和Ma等[12]检测了重度持续性哮喘血清及PBMC释放的IL-22和IL-25水平,也未发现其与健康人有差异。由此推测哮喘所具有的持续性气道炎主要局限于气道和肺部,细胞因子几乎不释放到全身。反之,另一组为急性发作期哮喘,其血清部分细胞因子升高,其中IL-6升高型、IL-6/TNF-α双高型占36.4%,因IL-6和TNF-α与急性感染、组织损伤导致的炎症相关,它可趋化中性粒细胞、单核吞噬细胞到炎症局部,促使急性期时相蛋白分泌。在放线杆菌诱导的猪肺炎模型中,血浆IL-6、TNF-α的水平在感染后10～20 h明显增高,并持续8～72 h不等[13]。肺炎支原体感染的猪肺炎模型中,肺泡盥洗液巨噬细胞内IL-1β、IL-8和TNF-α水平明显升高,TNF-α升高与细菌清除,炎细胞募集及局部肉芽肿形成关系密切[14]。且用IL-6基因敲除鼠制备的红球菌感染模型中,TNF-α量的产生比野生型鼠更高,说明IL-6和TNF-α在抗感染方面具有协同作用[15]。因此我们推测这两项细胞因子升高预示哮喘急性发作的诱因与细菌感染有关。T淋巴细胞表面的Toll样受体(TLR)识别病原体相关分子模式后,引起细胞因子信号瀑布式传递,IL-6或TNF-α通常短期内呈指数样升高,本研究也发现IL-6,TNF-α呈高幅上升,分别达正常的6.28～17.3倍。临床上通常用白细胞总数和中性粒细胞分类计数来协助判断是否合并细菌感染,但白细胞的动员和向外周释放均需要一定时间,而IL-6和TNF-α通常在急性感染2 h左右上升,对于外周血白细胞暂无升高的急性发作者,可以快速辅助鉴别。相关分析显示,IL-6和TNF-α均与外周血白细胞及CRP呈正相关,相关系数分别为0.63和0.67(P<0.05)。哮喘急性发作的诱因多种多样,如尘螨、花粉、油烟、冷空气、感染、运动、药物等,临床医师从接诊到治疗决策的时间很短,而可辅助判断细菌感染的指标较少。因此,在哮喘急性发作期是否给予抗生素治疗对医师来说是一项挑战。Lee等[16]调查了香港104例6～14岁儿童哮喘患者的急性发作(acute exacerbate,AE),其中在97次AE中,单纯AE为34.8%(32/97),AE合并感染为65.2%(65/97)。在合并感染中,39.2%被证明为病毒诱发。虽然研究者并没有直接给出细菌诱发的哮喘急性发作,但可推知其比例也不高。因此,合理结合IL-6、TNF-α、WBC、CRP等指标来综合判断是否合并细菌感染,具有潜在的临床意义。IL-5升高型和IL-17升高型占急性发作的45.4%,IL-5为Th2型细胞因子,推测该型急性加重可能由过敏性因素诱发。IL-17是由Th17细胞分泌,它参与胞外菌侵袭引起的迟发型免疫反应,这是否与非典型病原体感染相关还需进一步研究。细胞因子正常型占急性发作的18.2%。后3种细胞因子型提示该急性加重可能并非细菌感染诱发。

本研究采用CBA法,可检测组织培养上清、血清/血浆样本中可溶性多肽成分,如细胞因子、趋化因子、免疫球蛋白和过敏霉素等。包被了抗体的磁珠首先黏附目标多肽,将多肽定位在微整列的固定位置上,便于后期识别,随即用标记荧光的二抗与“磁珠-目标多肽”的二聚体结合,荧光越强说明目标多肽越多。ELISA也可检测可溶性多肽,是检测细胞因子的传统方法,但ELISA与CBA法比较具有较为耗时、需要样本量大等缺点。例如:ELISA法检测一项细胞因子要200μL标本,而CBA法仅需16μL。一套完整的ELISA法从包被孔板到出结果,需要2个工作日,而CBA法从样品分离到染色、上机、分析等仅需5 h。从检测灵敏度看,CBA法可检测<1.0 pg/mL的细胞因子,而ELISA至少为10 pg/mL。价格上虽然一个CBA试剂盒需要2 000多元,但通过成套定制可降低成本,且一个试剂盒可检测100个样品,单项成本并不昂贵。本研究中ELISA检测7个细胞因子的价格为350元左右,而采用CBA法检测的成本价仅为120元。另外,流式细胞仪检测技术(fluorescence activating cell sorter,FACS)是目前生物医学、免疫学和分子医学等的通用技术,它具有灵敏、快捷、多通道的优点。通过细胞内染色可检测胞内多种蛋白的含量,但FACS不适合用于可溶性介质的检测。而CBA法正是结合了微整列和流式细胞检测技术的优势,通过磁珠捕获,使可溶性介质获得了通过流式仪的可能,通过微整列,不同的磁珠出现的位置不同,从而来识别特定细胞因子,它可在微小标本中同时检测30多种可溶性介质,达到多通量的效果。

因此,CBA法用于栓测临床血清标本具有快速、微量、价格适中、便于重复的优势,且可根据不同需求灵活定制检测试剂盒。细胞因子水平在慢性持续期无明显升高,说明哮喘是气道和肺的局限性炎症。而IL-6和TNF-α升高可辅助判断由细菌感染诱发的急性加重[17],并快速指导抗生素的使用。

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The significance of cytometric beads array in detecting serum cytokine level for steady and acute exacerbation asthma

DU Chun-ling1,2, XU Kan3, MIN Zhi-hui4, SU Xiao-qiong1, DONG Nian1, BAI Feng-xi1,CHEN Zhi-hong1△

(1DepartmentofRespiratory,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China;2DepartmentofRespiratory,QingpuBranchofZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai201700,China;3DepartmentofGeriatrics,4ResearchCenter,ZhongshanHospital,FudanUniversity,Shanghai200032,China)

【Abstract】ObjectiveTo detect cytokines in serum for chronic asthma and acute exacerbation by cytometric beads array method (CBA), and to analyze characteristics of cytokine subgroup and their relation to clinical data.MethodsFourty chronic asthma,22 acute exacerbation of asthma and 18 healthy subjects were included.A little amount of blood was drawn from each subject (2 mL) and used for measuring cytokines by CBA to analyze their characteristics and correlation with clinical data.Regular blood test,C reaction protein and procalcitonin were measured by full automatic blood cell and biochemical analyzer.ResultsCBA kit of cytokine panels were custom-made,which included IL-5,IL-6,IL-10,IL-13,IL-17,TNF-α and IFN-γ.No differences were found in cytokine levels in chronic asthma when compared with healthy subjects.However, in acute exacerbation phase,there were 5 cytokine subgroups which were high IL-6 (22.8%),high IL-6/TNF-α(13.6%),high IL-5 (31.8%),high IL-17(13.6%) and normal cytokine (18.2%).The levels of IL-6 and TNF-α increased 6.28-12 folds and 17.3 folds respectively compared with healthy subiects. High IL-6 and High IL-6/TNF-α were positively correlated with WBC and CRP (R2=0.63,R2=0.67:P<0.05).Conclusion CBA was a reliable way to detect muti-cytokines in asthma serum in a short time.No differences were found in cytokine levels in chronic asthma.However,the specific cytokine panel (IL-6,TNF-α,WBC and CRP) may be helpful to identify the acute exacerbation caused by bacterial and guide appropriate antibiotic therapy.【Key words】cytokine;asthma;cytometric beads array method

【中图分类号】R 453.3

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1672-8467.2016.01.004

(收稿日期:2015-06-12;编辑:王蔚)

国家自然科学基金(81270078,81470211)

△Corresponding authorE-mail:czh60@hotmail.com