李世灵　蔡　扬　于燕妮

（1　贵州省贵阳市妇幼保健院病理科　贵阳　550003；2　贵阳医学院附属医院　贵州贵阳　550004）



口腔鳞状细胞癌中PLK1蛋白表达与中心体扩增

李世灵1蔡扬2#于燕妮2

（1贵州省贵阳市妇幼保健院病理科贵阳550003；2贵阳医学院附属医院贵州贵阳550004）

摘要：目的：探讨口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC）中保罗样激酶-1（Polo-Like Kinase 1，PLK1）蛋白表达与中心体扩增之间的相关性。方法：采用免疫组化SABC法检测10例正常口腔黏膜和47例OSCC中PLK1蛋白和γ-微管蛋白的表达情况，并分析两者之间的相关性。结果：PLK1蛋白和γ-微管蛋白在正常口腔黏膜组和OSCC组中的阳性表达率分别为0.0%（0/10）、70.2%（33/47）和0.0%（0/10）、76.6%（36/47），PLK1蛋白和γ-微管蛋白表达在正常口腔黏膜组和OSCC组之间的差异均具有统计学意义，P＜0.05；Spearman相关分析显示，OSCC组织中PLK1蛋白与γ-微管蛋白表达之间正相关，r=0.305，P＜0.05。结论：PLK1蛋白过表达可能是中心体扩增的潜在机制之一，PLK1蛋白过表达导致中心体扩增及细胞恶性增殖在OSCC发生中可能起一定的作用。

关键词：口腔鳞状细胞癌；保罗样激酶-1；γ-微管蛋白；中心体扩增

基因不稳定是人类肿瘤发生发展的中心环节，染色体不稳定性（Chromosome Instability，CIN）作为基因不稳定的形式之一，是肿瘤细胞一个非常显著的共同特征性表现。中心体异常被认为是染色体不稳定形成的潜在原因之一而与肿瘤发生有关。目前，中心体扩增可见人类大多数肿瘤中，其中也包括口腔鳞状细胞癌（Oral Squamous Cell Carcinoma，OSCC）［1］，但其扩增机制仍不清楚。有研究提示保罗样激酶-1（Polo-Like Kinase 1，PLK1）异常与中心体扩增、染色体不稳定及细胞恶性转化密切相关［2～3］。γ-微管蛋白作为一个典型的中心体核心蛋白，对于细胞周期的调控发挥很大重要［4］。我们通过采用免疫组化SABC法检测OSCC中PLK1蛋白和γ-微管蛋白的表达情况，初步探讨两者之间的相关性。

1　资料与方法

1.1临床病理资料选取2000～2007年贵阳医学院附属医院口腔科临床活检或手术切除标本，包括：经患者知情同意自阻生齿拔除时切除的正常牙龈黏膜组织10例、口腔黏膜上皮非典型增生组织29例（轻度14例，中度10例，重度5例）、OSCC组织47例（高分化33例，中分化11例，低分化3例；伴有淋巴结转移者31例，无淋巴结转移者16例；按2002 年WHO国际抗癌联盟制定的肿瘤分期标准：Ⅰ期和Ⅱ期共9例，Ⅲ期和Ⅳ期共38例）。病人术前均未接受任何手术或化、放疗治疗。所有组织均经病理检查确诊。

1.2实验试剂与方法

1.2.1实验试剂鼠抗人PLK1单克隆抗体（购自美国Santa公司，SC-17783），鼠抗人γ-微管蛋白单克隆抗体（购自美国Sigma公司，GTU-88），免疫组化SABC试剂盒、抗原修复液及DAB显色试剂盒（均购自武汉博士德生物技术有限公司）。

1.2.2实验方法所有组织均经10%福尔马林液固定后，制成蜡块并切片，切片用APES溶液制成的胶片捞片，通过二甲苯脱腊，梯度酒精水化后，将切片置于修复液中（pH6.0，0.01 mol枸橼酸盐缓冲液），高压热修复3 min，待冷却后用磷酸缓冲盐溶液（PBS）冲洗2次，5 min/次，滴加一抗（PLK1蛋白和γ-微管蛋白工作液稀释度分别为1∶100和1∶200），在室温孵育120 min；PBS液冲洗，滴加二抗，在室温下孵育30 min，PBS液冲洗，最后用DAB显色后苏木素复染10 s，流水冲洗，梯度酒精脱水后封片。每批染色同时设置阳性和阴性对照：以已知阳性标本为阳性对照，以PBS液取代一抗作为阴性对照。免疫组化结果由两位资深病理科医师独立判定取均值。

1.3结果判断PLK1蛋白以细胞浆或细胞核着黄色颗粒或团块为阳性染色，γ-微管蛋白以胞浆着黄色颗粒或团块为阳性染色。随机选取上皮或肿瘤区的5个不同区域，观察5个400倍高倍视野，计数阳性细胞数、阳性细胞百分率和评定显色强度，依照阳性细胞百分率＜5%，5%～25%，25%～50%，50%～75%，＞75%分别得0、1、2、3、4分；依照显色强度未着色、浅黄色、棕黄色、棕褐色分别得0、1、2、3分，两项得分相乘，并取5个高倍视野得分的平均值。按照分数分为4个等级：0～3为阴性（－），4～6为低表达（+），7～8为中表达（++），9分以上为高表达（+++）。（+）、（++）和（+++）的病例均归为阳性。

1.4统计学处理数据处理采用SPSS13.0统计软件，进行χ2检验、Fisher's确切概率法和Spearman相关分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1PLK1蛋白在正常口腔黏膜组织和OSCC中的表达情况PLK1蛋白在正常口腔黏膜组中未见阳性表达，在OSCC组中的阳性表达率达为70.2% （33/47），中、高表达共28例。PLK1蛋白阳性表达率在OSCC组显著高于正常口腔黏膜组，P＜0.05。见图1～图2。

图1　PLK1蛋白在正常口腔黏膜组织中的阴性表达（SABC×400）

图2　PLK1蛋白在口腔鳞癌组织中的阳性表达（SABC×400）

2.2γ-微管蛋白在正常口腔黏膜组织和OSCC中的表达情况γ-微管蛋白在正常口腔黏膜上皮基底层仅见极少数基底细胞胞浆阳性着色，按标准判为阴性表达；而在OSCC组织中的阳性表达率为76.6%（36/47），阳性细胞以中、高度表达为主呈大量散在分布，有的甚至满布视野。γ-微管蛋白表达在正常口腔黏膜组与OSCC组比较差异有统计学意义，P＜0.05。见图3～图4。

图3　γ-微管蛋白在正常口腔黏膜组织中的阴性表达（SABC×1000）

图4　γ-微管蛋白在口腔鳞癌组织中的阳性表达（SABC×1000）

2.3PLK1与γ-微管蛋白表达之间的相关性Spearman相关分析显示，OSCC组织中PLK1蛋白表达与γ-微管蛋白表达之间正相关，r=0.305，P＜0.05。见表1。

表1　口腔鳞癌组织中PLK1与γ-微管蛋白表达之间的相关性分析（例）

3　讨论

中心体异常可表现为中心体数目扩增、结构异常、中心粒周围物质聚集过多、中心体蛋白的异常磷酸化、无粒中心体、微管成核能力增强等［4］。中心体由中心粒和中心粒周围物质（Pericentriolar Materia，PCM）两部分组成，目前的相关研究提示中心体上恒定存在的蛋白（也即核心蛋白，指的是在用各种方法解聚微管之后它们的中心体定位并不会受影响）并不多，而γ-微管蛋白就是一个典型的中心体核心蛋白［5］，主要以γ-微管蛋白环式复合体（γ-Tubulin Ring Complex，γ-TuRC）和γ-微管蛋白小复合体（γ-Tubulin Small Complex，γ-TuSC）两种形式存在，γ-TuRC和γ-TuSC能与一些γ-微管蛋白复合体结合蛋白结合，锚定在微管组织中心参与微管成核起始。研究发现，向微管蛋白溶液中加入γ-TuRC，能够引起微管蛋白的聚集，微管成核能力随着γ-TuRC的浓度的增加呈线性增长［6］。Iemura K等［7］研究发现通过Western blot方法测定细胞中γ-微管蛋白的平均含量可以用来评价中心体扩增情况。本研究应用免疫组化的方法以γ-微管蛋白的单克隆抗体在OSCC细胞中的表达情况来评价中心体扩增情况，发现其结果与卢红等［8］应用免疫荧光方法检测OSCC组织中中心体扩增情况相似。

中心体上除了γ-微管蛋白等核心蛋白之外还存在随着细胞周期的改变而被中心体核心蛋白直接或间接招募到中心体上的一些调控因子，PLK1就是这些众多调控因子之一［9］。PLK1是一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，是细胞周期相关事件包括双极纺锤体形成、染色体分离和中心体成熟的重要调控因子［10～11］。大量研究发现，PLK1在许多恶性肿瘤中呈高表达，并与肿瘤的某些生物学行为密切相关［12～13］，提示PLK1可能在恶性肿瘤转化过程中发挥重要作用。本研究中，正常口腔黏膜组织未见PLK1蛋白阳性表达，而在OSCC中其阳性表达率为70.2%（33/47），以中、高度表达为主。本研究及相关报道说明，PLK1过表达确实普遍存在于实体肿瘤组织中，包括OSCC组织［14］。

癌细胞中过量的中心体可能导致染色体的错误分类及破坏，形成非整倍体性染色体，可导致肿瘤抑制基因的丢失，活化致癌基因［15］，故认为中心体可能是癌症形成的驱动力量而非结果，而PLK1对中心体成熟的必要性可能是其致癌作用的一种机制。中心体成熟实际上是γ-TuRC和其他的PCM向中心体聚集的过程。γ-TuRC的形成依赖于PLK1，但其完整的机制还并不清楚。有报道称［16］，作为γ-TuRC成员之一的Nedd1的磷酸化可能起到了重要的作用。Nedd1首先被CDK磷酸化，形成于一个与PLK1结合的区域，然后PLK1相继磷酸化Nedd1的另外4个位点，促进其与γ-tubulin的结合，以此决定γ-TuRC在中心体的募集。Yamamoto Y等［17］发现，发生PLK1过表达的膀胱癌与没有发生PLK1过表达的膀胱癌相比较，前者更易发生中心体扩增。本研究发现，在OSCC组织中，PLK1阳性表达与γ-微管蛋白表达之间正相关，r=0.305，P＜0.05，推测PLK1过表达可能通过直接调控中心体组分或对中心体相关蛋白磷酸化作用失调，而引发OSCC中心体扩增，从而导致异常纺锤体极形成和染色体分离错误，最终导致OSCC的形成。

参考文献

［1］Thirthagiri E，Robinson CM，Huntley S，et al.Spindle assembly checkpoint and centrosome abnormalities in oral cancer［J］.Cancer Lett，2007，258（2）:276-285

［2］De Carcer G，Malumbres M.A centrosomal route for cancer genome instability［J］.Nat Cell Biol，2014，16（6）:504-506

［3］Zou J，Zhang D，Qin G，et al.BRCA1 and FancJ cooperatively promote interstrand crosslinker induced centrosome amplification through the activation of polo-like kinase 1［J］.Cell Cycle，2014，13（23）:3685-3697

［4］Salisbury JL，Whitehead CM，Lingle WL，et al.Centrosomes and cancer ［J］.Biol Cell，1999，91（6）:451-460

［5］Joshi HC，Palacios MJ，McNamara L，et al.Gamma-tubulin is a centrosomal protein required for cell cycle-dependent microtubule nucleation［J］.Nature，1992，356（6364）:80-83

［6］Job D，Valiron O，Oakley B.Microtubule nucleation［J］.Curr Opin Cell Biol，2003，15（1）:111-117

［7］Iemura K，Kamemura K，Miwa M.Assessment of the centrosome amplification by quantification of gamma-tubulin in Western blotting ［J］.Analytical Biochemistry，2007，371（2）:256-258

［8］卢虹，杨宏，蔡扬.口腔鳞癌中心体扩增与p53 STK15蛋白表达相关性［J］.中国肿瘤临床，2013，40（13）:775-778

［9］Wang G，Jiang Q，Zhang C.The role of mitotic kinases in coupling the centrosome cycle with the assembly of the mitotic spindle［J］.J Cell Sci，2014，127（Pt19）:4111-4122

［10］Hyun SY，Hwang HI，Jang YJ.Polo-like kinase-1 in DNA damage response［J］.BMB Rep，2014，47（5）:249-255

［11］Kishi K，van Vugt MA，Okamoto K，et al.Functional dynamics of Polo-like kinase 1 at the centrosome［J］.Mol Cell Biol，2009，29（11）: 3134-3150

［12］Oliveira JC，Pezuk JA，Brassesco MS，et al.PLK1 expression and BI 2536 effects in childhood acute lymphoblastic leukemia［J］.Pediatr Blood Cancer，2014，61（7）:1227-1231

［13］Zhang Z，Zhang G，Kong C.High expression of polo-like kinase 1 is associated with the metastasis and recurrence in urothelial carcinoma of bladder［J］.Urol Oncol，2013，31（7）:1222-1230

［14］李世灵，蔡扬，于燕妮，等.口腔癌及癌前病变中PLK1蛋白表达及其意义［J］.临床实验病理学杂志，2010，26（1）:107-108

［15］Doxsey SJ.Centrosomes as command centres for cellular control［J］. Nat Cell Biol，2001，3（5）:E105-108

［16］Johmura Y，Soung NK，Park JE，et al.Regulation of microtubule-based microtubule nucleation by mammalian polo-like kinase 1［J］.Proc Natl Acad Sci U S A，2011，108（28）:11446-11451

［17］Yamamoto Y，Matsuyama H，Kawauchi S，et al.Overexpression of polo-like kinase 1（PLK1）and chromosomal instability in bladder cancer［J］.Oncology，2006，70（3）:231-237

·临床研究·

PLK1 Protein Expression and Centrosome Amplification in Oral Squamous Cell Carcinoma

LI Shi-ling1，CAI Yang2#，YU Yan-ni2
（1 Department of Pathology，Maternal and child health-care hospital of Guiyang City，Guiyang，Guizhou 550003；2 The Affiliated Hospital of Guiyang Medical College，Guiyang，Guizhou 550004）

Abstract:Objective: To study the correlation between polo-like kinase 1 protein expression and centrosome amplification in oral squamous cell carcinoma. Methods: The expressions of PLK1 and γ-tubulin proteins in 10 cases of normal oral mucosa and 47 cases of oral squamous cell carcinoma were investigated by SABC method，and analyzed the correlation between them. Results: Rate of positive expression of Plk1 protein and γ-tubulin in normal oral mucosa group and OSCC group were 0%（0/10），70.2%（33/47）and 0%（0/10），76.6%（36/47）respectively，and differences of Plk1 protein and γ-tubulin expression between OSCC group and normal oral mucosa group were statistically significant，P＜0.05. Spearman correlation analysis showed that the expression of PLK1 protein in OSCC tissue was positively correlated with the expression of gamma tubulin，r=0.305，P＜0.05. Conclusion: Over-expression of PLK1 protein may be a potential mechanism of centrosome amplification，while PLK1 protein leads to centrosome amplification and cell proliferation may play a role in the occurrence of OSCC expression.

Key words:Oral squamous cell carcinomas；Polo-like kinase 1（PLK1）；γ-Tubulin protein；Centrosome amplification

#通信作者：蔡扬，Email：caiyang85@163.com

中图分类号：R780.2

文献标识码：B

doi:10.13638/j.issn.1671-4040.2016.03.002

收稿日期：（2016-02-21）