植物染色体制片方法的改进

2016-06-16肖春林兵团第六师农业科学研究所新疆五家渠831300

新疆农垦科技 2016年3期

关键词：小麦

肖春林（兵团第六师农业科学研究所，新疆　五家渠　831300）

植物染色体制片方法的改进

肖春林
（兵团第六师农业科学研究所，新疆五家渠831300）

摘要：以普通小麦（2n = 6x = 42）为材料，对其种子进行发根，取其根尖分生区进行酶解法染色体制片。对比常规压片和去壁低渗火焰干燥法制片技术，酶解法制片技术易获得更好的分裂相，分布更加均匀的染色体片，更有利于后期的原位杂交进行信号标记实验。

关键词：小麦；根尖分生区；染色体制片

植物染色体制片技术是植物细胞遗传学、染色体工程、植物细胞生物学、植物细胞分类学和物种生物学等众多学科的基本实验技术[1]。对于染色体形态、结构、遗传行为及细胞变异等遗传学现象的分析，可以大大提高作物育种工作的效率和质量。因此，改善并提高染色体制片技术显得尤为重要。目前常用的染色体制片技术有2种，即普通压片技术和去壁低渗火焰干燥技术。前者虽然操作简单实用，但是需要制片者取材时间适宜，压片力量适中，对操作者的熟练程度要求较高；且处理一些细胞壁坚硬、难以软化的材料时，也不易获得良好的制片[2-3]。后者相比前者，需要的制片经验较少，且制片效果较好，但操作过程涉及酒精灯，需要火焰干燥和盖玻片压片，对染色体造成部分影响。酶解法在两者技术的基础上，对部分实验操作进行了改善，不仅可以得到分散良好的有丝分裂中期分裂相，而且还缩短了酶解的时间,提高了制片的效率，从而获得更好的染色体制片，为细胞学观察及相关的原位杂交（GISH）实验做准备。

1　材料与方法

1.1材料来源

市场购买的普通小麦种子。

1.2材料制备

1.2.1冷处理

将普通小麦种子置于装有湿润滤纸的培养皿内，小麦腹沟朝下贴在滤纸上，于4℃冰箱冷处理24h。

1.2.2发根、剪根

冷处理的种子放入25℃培养箱中培养24 h以上，待根尖长至2～3 cm时剪下。

1.2.3预处理

湿润根尖装于2mLEP管中，笑气处理2h左右。

1.2.4固定、保存

预处理的根尖用90%冰醋酸浸泡3～5 min后转入70%酒精中，4℃冰箱保存。

1.2.5清洗

用镊子取出固定根尖，蒸馏水反复漂洗3次，清洗干净后用丝巾擦尽根尖水珠。

1.2.6配制酶液

将提前配好的纤维素酶0.02 g与果胶酶0.01 g溶于1 mL柠檬酸钠缓冲液（灭菌）中，每20 μL分装于EP管中。

1.2.7酶解

剪取根尖分生区（乳白色）2mm左右，纸巾擦干其上水分，置于20 μL酶液EP管中，37℃水浴1h左右。

1.2.8漂洗、脱水

吸干EP管中酶液，加入50 μL蒸馏水，反复漂洗3次；吸尽EP管中蒸馏水，加100%C2H5OH脱水2次。

1.2.9滴片、照相

每一根尖加20 μL冰醋酸，用20 μL白色枪头捣碎根尖1 min，吸取10 μL溶液滴于载玻片上，加盖玻片，相差显微镜下观察照相。

1.3.0永久封片

液氮冷冻后用刀片将盖玻片和载玻片分离，分别干燥后用“指甲油”进行封片处理。

2　结果与讨论

按照酶解法制得的小麦根尖染色体片（未染色）如图1，染色体形态比清晰，且分布比较均匀，都为42条。但需要注意的是，用此方法制片若纤维素酶与果胶酶的比例浓度不够，在显微镜下观察时，会出现染色体重叠、分散不均匀或细胞壁及细胞质仍存在的现象，影响染色体的观察。

图1　普通小麦根尖分生区染色体图（2n = 6x = 42）

相比常规染色体制片方法，酶解法优点在于：（1）预处理中（笑气处理）相比传统的冰水混合物需处理24 h以上，该方法仅为2 h左右，大大缩短了处理时间；（2）对常规压片法中碰到细胞壁等坚硬无法软化的材料，酶解法利用纤维素酶和果胶酶可以溶解细胞壁、部分细胞质及两者之间的果胶物质，充分软化分散细胞，使染色体分布均匀；（3）避免了常规制片法中的手指压片及解剖针敲击来分散染色体并使之处于同一平面上的操作经验和力度问题；（4）整个操作过程中仅酶液浓度的酶解时间需要精确掌控，其他操作较规范，易把握。