于　欣， 王　静， 安　然， 梁兴国

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

ThermusaquaticusDNA连接酶的连接特性研究❋

于欣， 王静， 安然， 梁兴国❋❋

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东 青岛 266003)

摘要：为进一步研究Thermus aquaticus (Taq) DNA连接酶的作用机理、开发以DNA连接作为关键步骤的新生物技术，本文以含有超稳定发卡结构的DNA(带有11nt长的单链部分)和另一条单链DNA为连接底物，研究了片段长度、反应温度、连接位点的结构特性、聚乙二醇(Polyethylene glycol, PEG)的添加等对连接的影响，探讨了Taq DNA连接酶的连接特性。连接结果显示:单链DNA的3’端同发卡结构I底物相连的连接率，比单链DNA的5’端同发卡结构II底物相连的连接率更高；可以连接的最短单链DNA片段的长度为6nt；在20～65℃范围内，一般连接率随温度升高而升高。在连接时，由2条底物通过互补配对形成的复合体的热稳定性对连接率影响不大，一般在连接温度远远高于该复合体的熔点(Melting Temperature, Tm)时仍有很高的连接率。在70或75℃时，虽然连接率有所降低，但仍然可以连接9nt的单链DNA片段。研究还发现，在片段连接上，PEG 6000对较难连接的片段(6～7nt)有促进作用，对容易连接的片段(8～10nt)促进作用不显著，甚至有一定抑制作用。

关键词：Taq DNA连接酶；发卡结构；短片段

引用格式：于欣，王静，安然，等. Thermus aquaticus DNA连接酶的连接特性研究[J].中国海洋大学学报(自然科学版)， 2016, 46(5)： 50-55.

YU Xin, WANG Jing, AN Ran, et al. Investigation of the ligation characteristics of thermus aquaticus DNA ligase[J]. Periodical of Ocean University of China, 2016, 46(5): 50-55.

DNA连接酶在DNA的复制、重组和修复过程中扮演重要角色[1]。它以ATP或NAD+作为辅酶来催化2个DNA链之间的3’-羟基(3’-OH)和5’-磷酸(5’-P)形成磷酸二酯键。这2类连接酶的反应机理相近：(1)NAD+或ATP将其腺苷酰基转移到DNA连接酶赖氨酸残基的ε-氨基上，形成酶-腺苷酸共价复合物中间体，同时释放出烟酰胺单核苷酸(NMN)或焦磷酸；……