张 伟， 魏 蜜，王立华， 鲁旭东

(特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北工程学院生命科学技术学院，湖北孝感 432000)



不同样品前处理对转基因棉Bt蛋白含量测定的影响

张 伟， 魏 蜜*，王立华， 鲁旭东

(特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室，湖北工程学院生命科学技术学院，湖北孝感 432000)

摘要[目的]寻找一种稳定、准确、灵敏度高的检测转Bt植物中Bt杀虫蛋白的方法。[方法]比较几种ELISA方法检测Bt杀虫蛋白的效果，并就样品前处理方式以及温育时间、显色时间等影响因子进行分析。[结果]自制抗体法较试剂盒更为灵敏，其同一时期同一组织的Bt蛋白含量显著高于试剂盒，但不同方法对Bt蛋白含量的检测结果在时空表达变化的趋势上基本一致。样品在液氮研磨后抽提5或8 h，对检测结果影响较小，差异未达显著水平；匀浆机研磨过滤后离心与否，对检测结果影响较小。从样品前处理方式看，匀浆机较液氮研磨对样品组织蛋白的萃取效率更高，其检测结果显著高于液氮研磨处理的样品，差异达显著水平。温育时间和显色时间的延长会增加样品的吸光值，对蛋白含量检测值有一定影响，但差异不显著。[结论]不同样品前处理方式对转基因棉Bt蛋白含量测定存在显著影响。

关键词ELISA ；Bt毒蛋白；cry Lab /acrylamide试剂盒

目前，转Bt基因技术已发展成为微生物杀虫技术，被广泛应用于粮食、经济作物、蔬菜、林果以及卫生害虫的防治。转Bt基因技术的应用，可以降低农业成本，大幅度增加单位面积作物产量，减少作物中农药残留[1]。转Bt基因是目前应用最广泛和最有潜力的一个抗虫基因,已有近70 种植物被转入Bt基因而获得了抗虫性。但其基因漂移、生物多样性、对非靶标生物的潜在危害等环境安全、生态安全问题，要求必须对其实行有效监控，因此建立Bt蛋白检测方法十分必要[2]。

酶联免疫吸附测定法(ELISA)是目前应用最广泛的免疫检测方法，具有测定时间短、检测极限高、可定量分析等优点。国内已有ELISA 在转Bt 棉花、玉米、水稻和油菜[3-6]等中的应用。针对不同转基因作物中特异表达的蛋白质，许多公司设计了专一方法和商用试剂盒。美国 Virological 公司生产的 cry Lab /acrylamide试剂盒，是定量检测 Bt 杀虫蛋白的专用试剂盒，已在转基因 Bt棉花、玉米上得到了广泛应用[7]。但在应用其检测过程中，由于样品前处理方式以及检测处理时间的不同，造成不同检测结果的偏差。笔者比较了几种ELISA 法检测Bt 杀虫蛋白的效果，并就样品前处理方式以及温育时间、显色时间等影响因子进行分析,旨在为找到一种稳定、准确、灵敏度高的检测转Bt 植物中Bt 杀虫蛋白的方法提供理论依据。

1材料与方法

1.1试验材料1～9号棉花品种由湖北省农业科学院植保土肥研究所提供。

1.2试验药剂Cry1Ac/Cry1Ab检测试剂盒购自美国Virological公司；Detection Antibody、coating Ab、Poly-HRP dilution buffer、stock conjugate、四甲基联苯胺(TMB)由美国孟山都(Monsanto)公司提供。

1.3试验方法田间采集棉花组织样品，加干冰冷冻碎样，用冻存管迅速分装，置于-80 ℃超低温冰箱备用。

1.3.1样品前处理。匀浆机法：称取0.1 g样品于离心管内，加入8颗无油钢珠(6.3 mm)及10 mL抽提缓冲液(1×TBA)。匀浆机匀浆10 min，用血清过滤管过滤，小心吸取1 mL上清液，4 ℃低温保存。液氮研磨法：称取0.1 g样品于离心管内，放入研钵中，再倒入液氮，用研棒充分研磨，加入1 mL PBST缓冲液，摇床摇12 h后，4 ℃，10 000 r/min，离心20 min，小心吸取1 mL上清液，4 ℃低温保存。检测前，根据经验用抽提缓冲液对样品进行不同比例的稀释。标准曲线根据标准样品的含量进行等比梯度稀释[8]。

1.3.2检测方法。试剂盒法：使用美国Virological公司生产的Cry1Ac/Cry1Ab检测试剂盒，具体操作方法见试剂盒说明书。每孔加入50 μL酶交联物，立即加入稀释好的检测样品，26 ℃孵育1～2 h,洗涤3次。每反应孔加入底物100 μL， 26 ℃孵育15～30 min，后每孔加入100 μL终止液终止反应，用酶标仪在450 nm处测定每孔的吸光值(OD)。用计算机软件处理所测结果。根据标准样品的吸光值生成标准曲线，检测样品的浓度根据标准曲线计算。

自制抗体法：用50 mmol/L Na2CO3/NaHCO3+0.15 mol/L NaCA缓冲液将coating Ab稀释至蛋白质含量为2 μg/L。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加100 μL，用塑料纸密封,4 ℃过夜(≥8 h)。洗板3次，每孔各加入250 μL封闭液Blocker (1×PBST + 5%(W/V)BSA) 。将反应板贴膜密封后置于37 ℃温育60～90 min。迅速洗板3次，Cry1Ac阴性对照、阳性对照、标准样品及待测样品孔中每孔各加入100 μL，做3重复孔。封闭反应板并将反应板充分混匀后置于37 ℃温育60～65 min。迅速洗板3次，每孔中加入按照1∶1 875稀释的Detection Antibody 100 μL。封闭反应板并将反应板充分混匀后置于37 ℃温育60～65 min。迅速洗板3次，以1∶10 000比例用Poly-HRP dilution buffer将stock conjugate稀释，每孔加Poly-HRP conjugate工作液100 μL。封闭反应板并将反应板充分混匀后置于37 ℃温育30～32 min。将四甲基联苯胺(TMB)/底物置于室温，等量量取，每孔中加入TMB底物工作液100 μL，酶标板置于室温 (20～25 ℃)5 min。每孔中加入100 μL终止液(3 mol/L磷酸)混匀。10 min后，用酶标仪在450 nm处测定吸光值[9]。

2结果与分析

2.1不同处理方法对检测结果的影响从表1可以看出，不同前处理方式以及不同检测方法对同一品种同一组织外源Bt蛋白含量的检测结果差异达显著水平，如品种1，利用试剂盒法，在匀浆机和液氮研磨2种样品前处理方式下，苗期叶片Bt蛋白含量分别为(2 950.6±232.4)和(766.1±15.5)ng/gFW，差异达极显著水平；而自制抗体法，在匀浆机样品前处理方式下，1号品种苗期叶片Bt蛋白含量达(3 612±139.9)ng/gFW，与匀浆机+试剂盒法组合的检测结果差异不显著，但显著高于液氮研磨+试剂盒法组合的检测结果。从3个样品的检测结果可以发现，自制抗体法较试剂盒方法检测更为灵敏，其检测结果显著高于美国Virological公司生产的Cry1Ac/Cry1Ab检测试剂盒。而且样品前处理方式，即匀浆机处理样品和液氮研磨处理样品对检测结果的影响较大，从检测值来看，匀浆机对样品组织蛋白的萃取效率更高，显著高于液氮研磨处理方式。从棉花整个生长期来看，这2种方法在不同样品前处理方式下对Bt蛋白时空表达变化的检测结果基本一致。

表1　不同检测方法对叶片Bt蛋白检测结果的影响

注：同一品种同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05),不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)。

Note: Different lowercases and capital letters in the same column stand for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01),respectively.

2.2不同前处理方式对试剂盒检测结果的影响由表2可知，样品在液氮研磨后分别抽提5和8 h，两者的检测结果相差较小，差异未达显著水平；而样品在匀浆机研磨过滤后，离心20 min和不离心2种处理下，两者的检测结果差异不显著。而匀浆机研磨样品后，无论是否离心，其检测结果均显著高于液氮研磨处理的样品，差异达显著水平。

2.3不同温育时间和显色时间对试剂盒检测结果的影响由表3可知，8号品种在温育1.0 h、显色15 min处理下，吸光值为0.662 8±0.020 2，蛋白含量为(269.1±8.5)ng/g；但在温育1.5 h、显色30 min处理下，吸光值为1.069 0±0.082 5，极显著高于前者，但蛋白含量为(254.1±19.2)ng/g，与前者差异不显著。9号品种在温育1.0 h、显色15 min处理下，吸光值为0.899 5±0.010 5，蛋白含量为(369.5±4.5)ng/g；但在温育1.5 h、显色30 min处理下，吸光值为1.355 7±0.070 6，极显著高于前者，但蛋白含量为(320.9±16.5)ng/g，低于温育1.0 h、显色15 min的处理样品，与前者相比差异达显著水平。这表明温育时间和显色时间的延长会增加样品吸光值，对蛋白含量检测值有一定影响。

表2　不同前处理方式对叶片Bt蛋白检测结果的影响

注：同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05),不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)。

Note: Different lowercases and capital letters in the same column stand for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01),respectively.

表3　不同温育时间和显色时间对叶片Bt蛋白检测结果的影响

注：同一品种同列不同小写字母表示处理间差异显著(P<0.05),不同大写字母表示处理间差异极显著(P<0.01)。

Note: Different lowercases and capital letters in the same column stand for significant difference(P<0.05) and extremely significant difference(P<0.01),respectively.

3结论与讨论

酶联免疫吸附测定法的灵敏度受多种因素的影响,样品稀释、上样量以及其他试验条件要保持一致,试验结果才具有较强的可比性。从检测结果看，自制抗体法较试剂盒检测更为灵敏，其检测结果显著高于美国Virological公司生产的Cry1Ac/Cry1Ab检测试剂盒。而且样品前处理方式，即匀浆机处理样品和液氮研磨处理样品对检测结果影响较大，从检测值来看，匀浆机对样品组织蛋白的萃取效率更高，显著高于液氮研磨处理方式。这可能是由于匀浆机对棉花组织细胞的破碎程度更大，使外源Bt杀虫蛋白从棉花组织细胞释放出来的更多，从而导致2种前处理方式处理后的检测结果差异达显著水平。李建武等[10]指出,分离提取生物大分子物质首先要求其从原来的组织或细胞中以溶解的状态释放出来,选择适当的方法将组织或细胞破碎,破碎的程度越高,则目的物产量也越高。

其次，对前处理方式的影响因子进行分析发现，样品在液氮研磨后分别抽提5和8 h，两者的检测结果相差较小，差异未达显著水平；而样品在匀浆机研磨过滤后，离心20 min和不离心2种处理下，两者的检测结果差异不显著。而匀浆机研磨样品后，无论是否离心，其检测结果均显著高于液氮研磨处理的样品，差异达显著水平。这说明蛋白检测过程中，样品的研磨方式对组织内蛋白的释放影响较大。

温育时间和显色时间的延长会增加样品吸光值，对蛋白含量检测也有一定影响，但不稳定。因为酶联免疫吸附试验的关键之一是反应时间，时间过短，部分样品未来得及吸附即被洗掉，最终导致结果偏低；时间过长，又会影响正常反应，如本不该吸附的分子也会参加反应，最终杂质分子影响了结果。同时，标准曲线选择的标准蛋白浓度要适宜。毒蛋白测定的最终结果是通过标准蛋白浓度值与其吸光值的回归关系计算出来，如果标准蛋白值的范围过小，就会导致样品的结果超越了检测范围而失去实际意义。

参考文献

[1] 刘明,李海涛,刘荣梅,等.苏云金芽胞杆菌应用研究进展[J].黑龙江八一农垦大学学报,2014(4):9-13.

[2] JAMES C.Global status and distribution of commercial transgeniccrops in 1997[J].Biotech Develp Monitor，1998，35:9-12.

[3] CHEN S，WU J Y，CHENG D,et al.On the enzyme-linked immunosorbent assay of bacillus thuringiensis insecticidal protein expressed in Transgenic cotton[J].Acta gossypu sinica,1999,11(5):259-267.

[4] 刘光明,苏文金,陈向峰,等.应用ELISA 定量检测转基因玉米中Bt1蛋白的研究[J].食品科学,2002,23(8):217-219.

[5] 秦崇涛,陈在洁,苏军,等.3种ELISA法定量检测转cry1lAc基因水稻Cry1Ac蛋白的比较研究[J].福建农业科学,2003,18(4):258-263.

[6] 林良斌,周小云,官春云,等.转基因抗虫油菜的ELISA分析[J].湖南农业大学学报,2001,27(3):179-181.

[7] SAXENA D,FLORES S,STOTZKY G.Transgenic plants:Insecticidal toxinin root exudates from Bt corn[J].Nature,1999,402:480-481.

[8] 徐宝粱，苏宁，陈颖，等． 转基因棉子壳中 Bt 蛋白含量测定方法研究 [J].中国棉花，2004，31(2):12-14.

[9] 王保民，何钟佩，田晓莉． 苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1A 单克隆抗体的制备及在转 Bt 基因棉毒蛋白检测上的应用[J]．棉花学报，2000，12(1):34-39.

[10] 李建武,肖能赓,余瑞元，等.生物化学实验原理和方法[M].北京:北京大学出版社,1994:118.

Effects of Different Samples Pre-treatment on Determination of Protein Content in Transgenic Bt Cotton

ZHANG Wei,WEI Mi*,WANG Li-hua et al

(Hubei Key Laboratory of Quality Control of Characteristic Fruits and Vegetables,College of Life Science and Technology,Hubei Engineering University,Xiaogan,Hubei 432000)

Abstract[Objective] The aim was to seek a stable,accurate and high sensitive detection method for Bt insecticidal protein in transgenic Bt plants.[Method] The detection effect of several commonly used ELISA methods for Bt insecticidal protein were compared,pre-treatment methods and influencing factors such as incubation and coloration time were analyzed.[Result] The homemade antibody method was more sensitive than the kit,which measured Bt protein content in the same period and organization was significantly higher than the kit,but the detection results were basically the same in spatial-temporal expression change.After grinding the samples in liquid nitrogen and extracting for 5 or 8 h,there were less impact on the test results,the difference was not significant; homogenized and filtered centrifugal grinding machine or not,had little effect on the test results.From sample pre-treatment methods,the higher extraction efficiency compared to liquid nitrogen grinding machine homogenized tissue protein samples,the test results were significantly higher than the sample in liquid nitrogen grinding treatment,the difference was significant.Prolong of incubation and coloration would increase the sample absorbance values,and have a certain effect on the protein content detected values,but the difference was not significant.[Conclusion] Different samples pre-treatment has significant effects on determination of Bt insecticidal protein in transgenic Bt plants.

Key wordsELISA; Bt toxic protein; cry Lab / acrylamide kit

基金项目湖北省教育厅中青年人才项目(Q20152707)；国家自然科学基金项目(31200488)；特色果蔬质量安全控制湖北省重点实验室开放基金重点项目(2014K05)。

作者简介张伟(1991- )，男，湖北郧西人，硕士研究生，研究方向：植物病理、微生物应用。*通讯作者，讲师，博士，从事微生物学、植物病理学研究。

收稿日期2016-02-29

中图分类号S 188

文献标识码A

文章编号0517-6611(2016)08-141-03