张德清， 刘仁明, 2*， 张国强， 张 晏，熊 洋， 张川云， 李 伦， 司民真*

1. 楚雄师范学院物理与电子科学学院， 云南省高校分子光谱重点实验室， 云南 楚雄 675000

2. 中山大学物理科学与工程技术学院， 光电材料与技术国家重点实验室， 广东 广州 510275

胞嘧啶核苷在纳米银膜上的NIR-SERS光谱检测

张德清1， 刘仁明1, 2*， 张国强1， 张 晏1，熊 洋1， 张川云1， 李 伦1， 司民真1*

1. 楚雄师范学院物理与电子科学学院， 云南省高校分子光谱重点实验室， 云南 楚雄 675000

2. 中山大学物理科学与工程技术学院， 光电材料与技术国家重点实验室， 广东 广州 510275

采用一种高活性的纳米银膜作为表面增强拉曼散射(SERS)基底， 以近红外激光(785 nm)作为激发光源， 对胞嘧啶核苷(胞苷)水溶液(10-2～10-8mol·L-1)进行了近红外表面增强拉曼散射(NIR-SERS)光谱检测。 实验结果表明， 当胞苷水溶液浓度等于或低于10-7mol · L-1时， 可在300～2 000 cm-1范围内获得信噪比较好的NIR-SERS光谱。 将胞苷水溶液(10-2～10-5mol · L-1)分别滴在10片不同的纳米银薄膜上进行检测， 结果表明该纳米银膜体现出了较好的光谱重现性。 通过对纳米银膜表面形貌进行表征发现聚乙烯醇(PVA)包覆的纳米银颗粒在铝片表面形成“草状”结构。 并通过对吸附了胞苷分子的纳米银膜进行紫外-可见光反射光谱检测， 发现在800 nm处出现等离子共振峰。 因此采用785 nm的近红外激光作为激发光时， 该体系能够体现出强烈的表面等离子共振(surface plasmon resonance, SPR)特性。 同时采用DFT-B3LYP/6-311G对胞苷分子进行了拉曼光谱计算， 计算所采用入射光波长为785 nm， 通过计算结果与实验测得的胞苷固体的拉曼光谱对比发现在300～2 000 cm-1范围内两者匹配得较好， 进而对其振动进行了归属。 最后通过比较胞苷的拉曼光谱和NIR-SERS光谱对胞苷分子在纳米银膜上的可能吸附方式进行了分析。 分析结果表明胞苷分子主要为其核糖部分吸附纳米银颗粒上， 同时该分子的17NH2基团可能靠近局域电磁场增强区域。

纳米银膜; 表面等离子共振; 近红外表面增强拉曼散射; 胞嘧啶核苷

引 言

近年来SERS(surface-enhanced Raman scattering)作为一种快速、 高灵敏的物质检测技术[1]已被广泛地应用于DNA、 蛋白质等生物大分子物质[2]以及细胞、 微生物和癌组织切片[3, 4]等具有复杂组成结构的生命物质的检测。 但是在对于上述生物样品检测时存在两个基本问题， 首先是由于生物样品结构庞大并且组成成分复杂， 以及SERS的选择性增强作用， 导致并不是所有的物质结构或基团都能够被有效的检测到， 进而增加了光谱检测和分析的难度； 其次则是较高能量的激光会对测试生物样品产生“光致损伤”作用。 而使用近红外表面增强拉曼散射(NIR-SERS)光谱技术[5, 6]对构成生物体的基本组成分子的分析可能为一种有效的手段。 通过对基本组成分子进行检测和分析对生物样品的检测有着重要的意义。 NIR-SERS光谱技术采用近红外激光作为激发光源， 不仅具有SERS技术的高灵敏度、 猝灭荧光等的特性， 而且可以降低激光对生物样品损伤[7]。 胞苷是组成生命物质的基本分子之一， Watanabe等[8]报道了激发光为514.5 nm时胞苷(2×10-4mol · L-1)在银电极上不同电压下的SERS光谱， 然而其在600～1 000 cm-1区间仅在780 cm-1处有胞苷的唯一谱峰并伴随较强的高氯酸根的影响。 因此并不能反映胞苷分子的较为全面的振动信息， 同时说明该银电极基底对胞苷分子的增强效果较差。

使用通过电化学法在铝片表面制得具有“草状”， 同时尺寸达微米级别的银团簇的银薄膜作为检测基底， 采用近红外激发光(785 nm)对胞苷进行了光谱重现性和浓度梯度(10-2～10-8mol · L-1)检测， 实验结果表明该纳米银膜对胞苷具有较强的增强效果， 增强因子(EF)达到108， 并在10-2～10-7mol·L-1浓度区间获得了胞苷分子较为全面的振动谱峰。 对增强机理和胞苷分子在银膜上的可能吸附状态进行了分析。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

胞苷(≥99.0%)， 硝酸银(≥99.8%)， 聚乙烯醇(99.0%)， 无水乙醇(99.5%)， 高氯酸(≥70.0%), 铝片(≥99.0%)， 银电极(≥99.9%)。 实验用水为去离子水(≥18.25 MΩ·cm)。 便携式拉曼光谱仪(R-3000TM, 美国海洋光学公司)， 紫外-可见分光光度计(TU-1900, 北京普析通用仪器公司)， 扫描电镜(FEI QUANTA 200, 荷兰FEI公司)。

1.2 纳米银膜的制备

纳米银膜的制备方法为[9]： 首先将铝片进行机械抛光， 使得铝片表面平整。 然后将铝片放入由高氯酸与无水乙醇(体积比为1∶1)配置的抛光液中进行电化学抛光(电压为15 V)， 并用去离子水对抛光后的铝片进行反复冲洗。 然后将铝片和银电极放入200 mL硝酸银(20 mg)和聚乙烯醇(100 mg)的混合液中。 铝片作为阳极， 银电极作为阴极， 外加电压为20 V， 反应时间为60 s。 最后使用去离子水轻微冲洗， 在铝片表面可以观察到一层浅黄色银薄膜。

1.3 银薄膜表面结构表征及光谱测量

对银薄膜的表面形貌进行表征的是扫描电镜(工作电压30 kV)。 并使用紫外-可见分光光度计对纳米银膜以及滴加了胞苷溶液(10-3mol · L-1)的纳米银膜进行反射光谱测量， 以相同的铝片作为参比； 同时对胞苷的水溶液(10-3mol · L-1)进行了吸收光谱测量。 上述测量范围均为900～200 nm。 对胞苷进行拉曼和NIR-SERS光谱进行检测的是便携式拉曼光谱仪， 扫描积分时间为16 s。 具体过程为： (1) 将胞苷固体粉末压成圆形薄片后用于拉曼光谱检测； (2) 取浓度分别为0.46， 10-2和10-3mol·L-1的2 mL胞苷溶液进行拉曼光谱测量； (3)将不同浓度(10-2～10-8mol · L-1)的胞苷溶液(50 μL)滴在基底上， 待晾干后进行测量。

1.4 拉曼光谱计算

对于胞苷分子的拉曼光谱的计算是在Gaussian 09程序包中进行。 采用Becke的三参数交换函数与LYP相关函数相结合的密度泛函理论中的B3LYP方法[10]， 在6-311G基组水平上首先对胞苷分子进行几何优化得到胞苷分子的几何结构， 再在入射光为785 nm下使用与优化相同的方法对胞苷分子进行Raman光谱计算， 计算结果无虚频。

2 结果与讨论

2.1 基底表面形貌和UV-Vis消光光谱

图1(a)中A, B, C和D为纳米银膜表面在不同比例下扫描电镜图。 从图中可以看出， 该“草状”银团簇[9](其纳米颗粒由PVA所包覆)的尺寸可达到微米级别， 并在铝片表面凸起， 同时不同纳米银颗粒之间存在距离大小不等的间隙凸起或凹陷部分。 徐红星等[11]的研究表明在纳米颗粒之间的间隙、 凸起或凹陷附近电场可以得到很大的增强。 因此， 该结构具有较强的SERS增强效果。 图1(b)中谱线a为胞苷分子的紫外-可见吸收光谱， 其吸收峰位于270 nm处， 并在300～900 nm区间无等离子体共振峰， 而检测时采用的激发光的波长为785 nm， 因此无共振拉曼散射因素影响。 谱线b和c分别为纳米银膜和吸附了胞苷分子的纳米银膜的紫外-可见光反射光谱图， 由谱线b可以看出该纳米银膜在350～900 nm区间出现消光现象， 且表面等离子体共振峰位于461 nm处。 同时谱线c为吸附了胞苷分子的纳米银膜的紫外-可见光反射光谱， 与谱线b相比， 两者消光区间基本相同， 但在800 nm处出现新的等离子共振峰， 因此根据SERS的电磁场增强机制， 采用785 nm的近红外激光作为激发光源时， 该活性基底能够体现出强烈的表面等离子体共振特性[11-12]。

Fig.1 Scanning electron microscope (SEM) of the PVA-Ag nano-silver film prepared by using electrochemical deposition for 60 s (a) and ultraviolet-visible absorption spectra of cytidinea; Ultraviolet-visible reflectance spectra of nano-silver filmband nano-silver film after addition of cytidine aqueous solutionc(10-3mol · L-1) (b)

2.2 胞苷的NIR-SERS光谱

当采用拉曼光谱仪直接测量固体胞苷时可以获得信噪比较好的拉曼光谱图(图2a)。 但是将胞苷溶解在水中时则其拉曼散射信号将减弱， 如图2b为胞苷0.46 mol · L-1溶液的拉曼光谱， 由光谱图可知在该浓度下仅在782 cm-1处有一较弱的谱峰。 当胞苷水溶液浓度下降到10-2mol · L-1时， 则基本上未检测出其拉曼信号(图2c)。 这是由于拉曼散射的内在属性所决定的， 即灵敏度低[13]， 当胞苷溶于水后， 参与散射的分子数目减少， 因此拉曼信号减弱， 故当浓度下降后未能检测出有效的拉曼信号。 但是将胞苷水溶液滴加在具有纳米银膜上时， 由于LSPR增强作用， 使得其拉曼信号被放大， 因此能检测出信噪比较好的NIR-SERS光谱(图3b)。

Fig.2 Raman spectra: a Cytidine; b Cydidine aqueous solution (0.46, 10-2, and 10-3 mol · L-1)

图3a为纳米银薄膜的背景信号， 除在657 cm-1处有一微弱的谱峰外基本无其他杂峰， 说明该纳米银薄膜是一种背景较为干净的SERS活性基底， 对被检测物质的干扰很小。 图3b～g分别为胞苷不同浓度(10-2～10-8mol · L-1)下的NIR-SERE光谱， 从实验结果可知， 当浓度下降时， 由于薄膜上单位面积内分子数降低， 进而使得拉曼散射信号减弱， 当浓度下降至10-8mol·L-1时， 则不能检测出其拉曼信号。

Fig.3 NIR-SERS spectra of nano-silver film (a) and cytidine aqueous solution (b—h)

为了检测胞苷分子的光谱重现性， 我们分别对胞苷溶液浓度为10-3～10-5mol·L-1进行了检测。 即将每个浓度的溶液分别滴加在10个不同的纳米银薄膜上， 如图4所示， 虽然在相同浓度下谱峰的强度存在差异， 但是谱峰的峰形和相对谱峰面积比变化不大， 同时通过对胞苷10-2mol·L-1的NIR-SERS光谱的相对谱峰面积比进行了统计研究， 其中谱峰面积比I595/I1 022，I787/I1 022，I1 300/I1 022和I1 629/I1 022分别为0.383±0.135， 1.096±0.244， 1.685±0.125和0.946±0.157， 表明谱峰面积比的离散度较小， 因此使用该活性基底检测胞苷分子时体现出了较好的光谱重现性。

Fig.4 NIR-SERS spectra of cytidine adsorbed on the different nano-silver films (a)： 10-3 mol·L-1； (b)： 10-4 mol · L-1； (c)： 10-5 mol·L-1

2.3 胞苷分子的吸附分析

图5为优化得到的胞苷分子的几何结构。 表1为通过计算得到的胞苷分子的拉曼光谱谱峰及其振动归属， 以及实验测得的胞苷固体的拉曼光谱谱峰和胞苷溶液在纳米银膜上的NIR-SERS光谱谱峰。 通过理论计算与实验测得的拉曼光谱进行了比较， 发现在300～2 000 cm-1范围内理论值与实验值符合的很好。

通过对比浓度为10-3mol·L-1的胞苷水溶液的拉曼光谱和NIR-SERS光谱发现在300～1 700 cm-1范围内有17处谱峰得到了增强。 其中有4处谱峰产生了极大的增强效果，

Fig.5 Calculated structure of cytidine molecule

Table 1 Assignments of Raman and NIR-SERS spectra (Incident light 785 nm) of cytidine

aKey： w=weak; vw=very weak; m=medium; s=strong; vs=very strong.δ=bending mode;ν=stretching mode;γ=rocking mode. C=cytosine; R=D-ribose

2.4 纳米银膜的增强因子(EF)

纳米薄膜的表面增强拉曼散射增强因子(EF)的计算模型与文献[14]相同。 即在激发光波长、 功率、 采集时间和检测灵敏度相同的采集条件下， 根据如下的计算关系式计算增强因子[15]

式中Isurf和Ivol分别为胞苷在纳米银膜表面和溶液中所测得的谱峰(782cm-1)强度，Nsurf和Nvol分别表示在纳米银膜表面和溶液中所检测的分子数。 在检测过程中对胞苷溶液(0.64mol·L-1)的拉曼散射有贡献的分子数约为1.22×1017； 在胞苷的(10-6mol·L-1)NIR-SERS检测中的有效分子数约为1.75×109。 因此该纳米银膜的增强因子可达6.5×108。

3 结 论

通过对纳米银膜的表面形貌的表征和对紫外-可见光反射光谱的分析发现该银膜具有较宽的表面等离子共振带， 是一种具有较强SPR增强效果的SERS基底。 在该纳米结构的银膜上， 实现了胞苷分子的低浓度NIR-SERS光谱检测， 结果表明当浓度等于或高于10-7mol·L-1时可以获得胞苷分子较为完整的光谱谱峰信息。 同时该基底在检测胞苷是体现出了较强的光谱重现性。 并进一步分析了胞苷分子在银膜上的吸附方式， 分析表明胞苷分子主要为其核糖部分吸附纳米银颗粒上， 同时该分子的17NH2基团可能靠近局域电磁场增强区域。

[1] TAO Qin, DONG Jian， QIAN Wei-ping(陶 琴， 董 健， 钱卫平). Progress in Chemistry(化学进展)， 2013， 25： 1032.

[2] Ou L, Chen Y, Su Y, et al. J. Raman Spectrosc., 2013, 44(5): 680.

[3] YU Yun, LIN Ju-qiang, HUANG Hao, et al(俞 允， 林居强， 黄 浩， 等). Prog. Biochem. Biophys.(生物化学与生物物理进展), 2011, 38(10)： 961.

[4] Wu X M, Xu C, Tripp R A, et al. Analyst, 2013, 138: 3005.

[5] Feng S Y, Lin J Q, Cheng M， et al. Appl. Spectrosc., 2009, 63(10): 1089.

[6] Mahajan S, Abdelsalam M, Suguwara Y, et al. Phys. Chem. Chem. Phys., 2007, 9: 104.

[7] GUO Xing-can, GUO Jun-huai, HE Xi-wen, et al(郭星灿， 郭俊怀， 何锡文， 等). Acta Chimica Sinica(化学学报)， 2003， 61(5)： 785.

[8] Watanabe T, Kawanami H, Katoh H, et al. Surf. Sci, 1985, 158: 341.

[9] Liu R M, Zhu S M, Si M Z, et al. J. Raman. Spectrosc., 2012, 43: 370.

[10] LIANG Xiao-jing, CUI Li, WU De-yin, et al(梁晓静， 崔 丽， 吴德印， 等). Acta Phys. Chim. Sin.(物理化学学报)， 2009， 25(8)： 1605.

[11] WEI Hong, XU Hong-xing(魏 红， 徐红星). Sci. China Ser. G.(中国科学： 物理学 力学 天文学)， 2010， 40(1)： 1.

[12] TONG Lian-ming, XU Hong-xing(童廉明， 徐红星). Physics(物理)， 2012， 41(9)： 582.

[13] DING Song-yuan, WU De-yin, YANG Zhi-lin, et al(丁松园， 吴德印， 杨志林， 等). Chemical Journal of Chinese University(高等学校化学学报), 2008， 12： 2569.

[14] Liu R M, Zhang D Q, Cai C B, et al. Vib. Spectrosc., 2013， 67： 71.

[15] Le Ru E C, Blackie E, Meyer M, et al. J. Phys. Chem. C, 2007, 111： 13794.

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NIR-SERS Spectra Detection of Cytidine on Nano-Silver Films

ZHANG De-qing1, LIU Ren-ming1, 2*, ZHANG Guo-qiang1, ZHANG Yan1, XIONG Yang1, ZHANG Chuan-yun1, LI Lun1, SI Min-zhen1*

1. Yunnan Key Laboratory of Universities for Molecular Spectrum, School of Physics and Electronic Science, Chuxiong Normal University, Chuxiong 675000, China

2. State Key Laboratory of Optoelectronic Materials and Technologies, School of Physics and Engineering, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, China

The polyvinyl alcohol (PVA) protected silver glass-like nanostructure (PVA-Ag-GNS) with high surface-enhanced Raman scattering (SERS) activity was prepared and employed to detect the near-infrared surface enhanced Raman scattering (NIR-SERS) spectra of cytidine aqueous solution (10-2～10-8mol·L-1). In the work, the near-infrared laser beam (785 nm) was used as the excitation light source. The experiment results show that high-quality NIR-SERS spectra were obtained in the ranges of 300 to 2 000 cm-1and the detection limit of cytidine aqueous solution was down to 10-7mol·L-1. Meanwhile, the PVA-Ag-GNS shows a high enhancement factor (EF) of ～108. In order to test the optical reproducibility of PVA-Ag-GNS, ten samples of cytidine aqueous solution (10-2～10-5mol·L-1) had been dropped onto the surface of PVA-Ag-GNS respectively. Meanwhile, these samples were measured by the portable Raman spectrometer. As a result, the PVA-Ag-GNS demonstrated good optical reproducibility in the detection of cytidine aqueous solution. In addition, to explain the reason of enhancement effect, the ultraviolet-visible (UV-Vis) extinction spectrum and scanning electron microscope (SEM) of cytidine molecules adsorbed on the surface of PVA-Ag-GNS were measured. There is plasmon resonance band at 800 nm in the UV-Vis extinction spectrum of the compound system. Therefore, when the near-infrared laser beam (785 nm) was used as excitation light source, the compound system may produce strongly surface plasmon resonance (SPR). According to the SEM of PVA-Ag-GNS, there are much interstitial between the silver nanoparticles. So NIR-SERS is mainly attributed to electromagnetic (EM) fields associated with strong surface plasmon resonance. At last, the geometry optimization and pre-Raman spectrum of cytidine for the ground states were performed with DFT, B3LYP functional and the 6-311G basis set, and the near-infrared laser with wavelength of 785 nm was employed in the pre-Raman spectrum calculation process. The calculation results without imaginary frequency and the results match pretty well with the experimental Raman spectrum. At the same time, the assignations of Raman bands and adsorption behaviors of cytidine molecules on the surface of PVA-Ag-GNS are also discussed. According to our experiment and calculations, cytidine molecules mainly adsorbed on silver nanoparticles via the ribose moiety and amino group may get close to the local electromagnetic field.

Nano-silver film; Surface plasmon resonance; NIR-SERS; Cytidine

Nov. 18, 2014; accepted Feb. 8, 2015)

2014-11-18，

2015-02-08

国家自然科学基金项目(13064001， 11064001， 10864001)和云南省应用基础研究计划项目(2013FD044)资助

张德清, 1987年生， 楚雄师范学院物理与电子科学学院讲师 e-mail: cxzdq@live.com *通讯联系人 e-mail: siminzhen@hotmail.com; liurenmingok@126.com

O657.3

A

10.3964/j.issn.1000-0593(2016)03-0743-06

*Corresponding authors