谭峰+才巧玲+马志欣+孙雪成+侯召龙

摘要：为了从分子水平探讨水稻病菌的传播和发病机制，特别是与分子病理学和分子药物学有关的研究项目的开展，需要研究细胞内生物大分子的结构及结构与功能的关系。利用拉曼光谱仪对正常水稻叶片进行拉曼光谱采集，指认出水稻叶片细胞中重要组成成分的拉曼特征频率，如羰基、亚甲基、巯基、氨基等多种官能团，并对拉曼光谱曲线中出现的特殊结构进行理论分析和解释。然后针对细胞组成的两大成分，即蛋白质和遗传物质的结构构像进行相应的拉曼光谱分析。通过分析水稻叶片中各部分的二级结构构象给出全面的分析和解释，实现了水稻叶片半定量分析的目的。为今后寒地水稻病害早期检测的对比分析提供了理论基础。

关键词：拉曼光谱；蛋白质；遗传物质；官能团；二级结构

中图分类号： S511.01

文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）04-0358-03

寒地水稻是指东北地区所产的单季晚稻品种。水稻病害是影响寒地水稻产量的重要因素之一，每年均有病害发生，严重时可以减产40%～50%[1-2]。研究水稻病害内部发病机制以及对水稻叶片结构破坏的机制具有重要意义。对水稻叶片检测通常采用透射电镜、多光谱成像技术、高光谱成像技术等方法，这些方法已经能够较准确地识别水稻病害情况，但仍存在识别方法普适性差、无损检测方法缺失的问题[3]。拉曼光谱是一门基于拉曼散射效应而发展起来的光谱分析技术，体现的是分子的振动或转动信息，与常规化学分析方法相比，拉曼光谱技术具有无损、快速、环保、灵敏度高、稳定性好且无需制样等特点[4-5]。崔向荣等利用拉曼光谱技术检测骨髓间充质干细胞在电磁场照射后蛋白质、脂类、核酸等结构和数量的变化的可行性，得出3 000 Hz 脉冲电磁场对骨髓间充质干细胞产生了分子层面的影响[6]。Waleed等利用拉曼光谱技术检测PC12细胞裂解液在细胞内DA水平的生化成分的变化[7]，同时确定拉曼光谱在检测细胞外DA水平处理剂的变化与运用高效液相色谱法结果一致。董蓉等应用单细胞拉曼分析技术结合PCA方法，以枯草芽孢杆菌芽孢为对象，探究芽孢在强碱胁迫下的致死机制[8]。由此可见，利用拉曼光谱技术在生物、农业等方面的应用越来越广泛，已经成为一种有效的检测手段。但目前利用拉曼光谱对水稻植株检测的研究较少。因此，本研究利用拉曼光谱和水稻叶片细胞组织的知识理论进行研究，以期为水稻病害早期检测的对比分析提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

水稻叶片样本2011—2014年采集于黑龙江省农垦总局建三江分局下属胜利农场科技示范园区的26.67 hm2试验田，品种为垦稻19号。水稻是蒸腾作用非常强的农作物，正常天气采集下来的水稻叶片10 min之内便会因为叶片水分降低出现明显的卷叶现象，所以采集样本必须现场采摘叶片，并直接在附近的室内进行拉曼光谱采集。

1.2 试验方法

选用由DeltaNu公司生产的Advantage 532型拉曼光谱仪，采用背向接收的方式采集拉曼光谱信号，在波段200～3 400 cm-1 范围内对现场样本进行拉曼光谱采集。采集到的原始数据，一是利用编写的Matlab程序进行数据处理，得到样本光谱的峰值，并显示处理以后的光谱图像；二是通过结合Berjot方法针对二级碳、三级碳、四级碳以及谱线展宽与水稻叶片内结构进行关联分析，对照拉曼光谱特征频率表，得到寒地水稻叶片中大部分关键化学键的拉曼光谱分析结果[9]。

2 结果与分析

2.1 细胞中重要成分在拉曼光谱中的分析

利用拉曼光谱分析仪在中等激光强度、532 nm波长、曝光时间1 s、无偏振检测的条件下采集正常水稻叶片的拉曼光谱，采集波数范围为200～3 400 cm-1。几丁质结合蛋白是在植物中主要存在的物质，其中半胱氨酸（cysteine）是几丁质结合域的主要特征。半胱氨酸分子式为HSCH2CH（NH2）COOH，它含有羰基—CO、亚甲基—CH2—、巯基—SH、氨基—NH2等多种官能团。446、535 cm-1分别对应半胱氨酸羧基（—COOH）的面内摇摆振动和面外摇摆振动，是区别于胱氨酸、乙酰半胱氨酸的标志特征峰。从峰值相对强度可以看出在水稻叶片中半胱氨酸含量相对较少，导致标志特征峰强度低。695 cm-1为半胱氨酸的C—S键，其实此处谱峰是693、 695 cm-1 峰的叠加谱峰，但由于仪器分辨率不高，故只能看到1个明显的拉曼峰。990、1 043 cm-1为半胱氨酸中的甲基（—CH3），它们同属于甲基的面内摇摆振动。同时可以看到 990 cm-1峰的强度偏弱，再次说明半胱氨酸的含量较少。1 043 cm-1附近峰是个椅形结构，在1 043 cm-1附近的几个波数内是一种水平结构，这是由于受附近1 050 cm-1谱峰交叠影响而不能表现为突出的峰（图1-a）。1 349、1 365、1 385、1 392、1 412 cm-1等为半胱氨酸分子中—CO的伸缩振动与—O—H键偶合的拉曼谱峰，在这些拉曼谱峰中以波数 1 392 cm-1峰相对强度最大。1 348、2 966 cm-1为半胱氨酸中的亚甲基（—CH2）的伸缩振动和变形振动（图1-b）。

1 680～1 710 cm-1为巯基（—SH）在周围不饱和键化学环境影响下的吸收峰；1 700～1 640 cm-1为饱和键化学环境影响下的吸收峰。2 498 cm-1为巯基的伸缩振动，说明在植物叶片中具有巯基的存在；同时，处在不饱和巯基频率范围段内的峰值有1 687、1 699、1 710 cm-1等3个；在饱和巯基频率范围段内的峰值有1 641、1 653、1 670、1 687、1 699 cm-1 等5个（图1-c、图1-d）。

2.2 水稻蛋白质的主链构象与二级结构分析

从水稻叶片的拉曼光谱中可以得到许多可贵的信息，包括叶片蛋白质中类似于芳香族组成的氨基酸的信息，进一步得到的二级结构的信息。蛋白质的主链构象的拉曼光谱复杂多样，但它们主要由骨架C—C、C—N和肽键（—CONH—）引起。C—C伸缩振动的谱线，α-螺旋区域在890～945 cm-1，无规卷曲区域在945～960 cm-1，且构象灵敏；而C—N伸缩振动在1 070～1 130 cm-1，且构象灵敏。蛋白质中的肽键可以引起多种类型的振动模式，分别叫做酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ、酰胺Ⅳ。其中酰胺Ⅰ是肽键中的羰基（—CO）伸缩振动，在自由结构中的谱峰在1 670～ 1 700 cm-1，在结合结构中在1 630～1 680 cm-1；酰胺Ⅲ是C—N键的伸缩振动，在拉曼光谱中为强谱线，谱峰所在位置在1 290 cm-1附近。它们对蛋白质的构象变化十分敏感，而酰胺Ⅰ峰在拉曼谱图上明显，但是拉曼谱图上的酰胺Ⅱ峰及NH峰非常弱以致不好辨识。在研究蛋白质的及多肽结构时，由于谱峰过多，酰胺Ⅱ和酰胺Ⅳ就起不到作用。蛋白质结构中某些氨基酸含有C—S键，它有2种构象，其中632、646.5、661 cm-1为含有扭曲构象的C—S键；704、721、743 cm-1为含有反式构象的C—S键。1 410 cm-1附近为羧基（—COOH）对称伸缩振动；2 550～2 590 cm-1 之间存在巯基（—SH） （图2）。

851、828 cm-1的双峰为酪氨酸（C9H11NO3）对羟苯基环的呼吸振动和环平面外弯曲振动的倍频之间的费米共振引起的，且双峰随侧链微环境而改变。现在的强度比值I851/828=30 968/31 854=0.972，该值小于1，说明该酪氨酸的部分是埋藏在蛋白质分子内部。对酪氨酸残基进行计算，其中酪氨酸的残基满足如下表达式：

N埋+N露=1；

0.5N埋+1.25N露=I851/828。（1）

得到N露≈0.63，N埋≈0.37。但需要注意，因为水稻叶片光谱采集在有荧光处采集而非在暗室中采得，计算所得酪氨酸残基误差相对较大，但是在有误差的情况下说明了一定的蛋白质构型问题。与酪氨酸对应的谱线还有647、1 177、1 211、1 610、1 624 cm-1等5条谱线[9]。

色氨酸中具有吲哚环。吲哚是吡咯与苯并联的化合物，别称苯并吡咯，分子式为C8H7N。2种并合方式，分别称为吲哚和异吲哚。吲哚是一种亚胺，具有弱碱性；杂环的双键一般不发生加成反应；在强酸的作用下可以生发二聚合和三聚合作用；在特殊的条件下，能进行芳香亲电取代反应。色氨酸的吲哚环引起的谱线分别在759、875.5、1 012、1 334、1 367、1 550、1 624 cm-1附近。其中吲哚环的N—H弯曲振动谱线在 1 435 cm-1 处，而1 367 cm-1的谱线对于周围化学结构环境的改变是非常敏感的，可以看出的谱线是钝形峰，说明色氨酸中的吲哚还是暴露在蛋白质结构以外，如果色氨酸残基是埋藏的，该谱线会呈尖锐峰形（图2）。

1 004 cm-1为苯丙氨酸的单基取代苯环是引人注意的强峰，但它的构象不灵敏，如果蛋白质没有共价键断裂，可以作为内标，属于苯丙氨酸残基的谱线还有624、1 609、1 624 cm-1等3条谱线。如果在纯蛋白质水溶液中，还有1 032、 1 203 cm-1 等2条谱线，但是由于残基受到其他基团的影响，在水稻叶片的蛋白质拉曼光谱中没有得到体现。S—S键有3种构象，在（510±5） cm-1出现的谱线属于扭曲-扭曲-扭曲构象（gauche-gauche-gauche），在（525±5） cm-1的谱线属于扭曲-扭曲-反式构象（gauche-gauche-trans），在（540±5） cm-1的谱线属于反式-扭曲-反式构象（trans-gauche-trans）。

2.3 水稻核蛋白及遗传物质的二级结构分析

虽然组蛋白是蛋白质成分的一部分，根据细胞组成来看，也不宜作为纯蛋白质进行分析，所以将其归入遗传物质进行拉曼光谱分析。核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白构成。其中，DNA是细胞的主要遗传物质，是一种长链聚合物，由4种脱氧核苷酸，即腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶组成，一般由C、H、O、N、P等5种元素组成。1个脱氧核苷酸分子由3个分子组成，即含氮碱基、脱氧核糖和磷酸。而糖类和磷酸分子借由酯键相连，组成长链骨架。由于细胞核内相对湿度比较大，所以DNA的构象是一种含水量大的构象形式，其特征谱线大约在840 cm-1波数上。脱氧核酸的谱线有4根，分别为1 446、1 467、924、984 cm-1。脱氧核糖的谱线有934、1 012、1 051、1 066、1 446 cm-1等5条，其中 1 012、1 051 cm-1 的谱线属于脱氧核糖的C—O伸缩振动，721、1 223、1 306、1 335、1 505 cm-1属于腺嘌呤一些基团的谱线。1 492 cm-1 属于鸟嘌呤的一些基团的谱线。1 528、1 385、1 262 cm-1 的谱线分别属于腺嘌呤和胞嘧啶，胸腺嘧啶、胞嘧啶和鸟嘌呤，以及鸟嘌呤和胞嘧啶的一些基团。属于包括碱基之间氢键在内的胸腺嘧啶羰基的伸缩振动的谱线在 1 670 cm-1 处，当碱基之间的氢键断裂时该谱线会向低波数位移。1 197 cm-1的谱线属于碱基外C—N伸缩振动。DNA骨架磷酸基团的谱线有2根，它们是在774 cm-1的磷酸二酯PO2对称伸缩振动的谱线和1 089 cm-1磷酸离子对称伸缩振动。

属于碱基腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的谱线如下：（1）属于腺嘌呤（A）的有720、1 250、1 305、1 334、1 426、1 492、1 517 cm-1；（2）属于鸟嘌呤（G）的有686、1 325、1 426、1 492 cm-1；（3）属于胞嘧啶（C）的有1 250 cm-1；（4）属于胸腺嘧啶（T）的有661、1 211、1 237、1 653 cm-1。

RNA骨架磷酸基团有2根谱线。其中磷酸离子对称伸缩振动在1 103.5 cm-1处谱线是构象不灵敏的，构象灵敏的磷酸二酯PO2对称伸缩振动的谱线在813 cm-1处。若磷酸骨架处于有序的状态时，会在813 cm-1处产生强的拉曼光谱。而若RNA的构象变为无序时它将移位到808～795 cm-1 之间的某个谱线处。对于RNA的4种碱基特征拉曼谱线与DNA中相一致。

碳水化合物是组成细胞内糖蛋白和糖脂的重要成分，它们在细胞通信和供应细胞活动所需的能源方面扮演了重要的角色。对于能以高度支链化形式及α、β-糖苷异构形式存在的寡糖链，其种类和连接方式非常多，它能以最小的结构单位承载最大的生物信息量而成为最理想的信息载体。糖蛋白的糖类部分与细胞的抗原结构、受体、细胞免疫、细胞识别等有密切关系。根据谱图分析，获得该细胞内的部分碳水化合物的信息：（1）属于葡萄糖的有550、743、1 025、1 051、1 076、1 119、1 349 cm-1；（2）属于D-甘露糖的有743、924、955、1 076、1 103 cm-1；（3）属于葡萄糖醛酸的有564、743、1 025、1 051、1 076、1 119、1 349 cm-1；（4）属于N-乙酰基葡萄糖的有743、984、1 025 cm-1。

3 结论与讨论

本研究从细胞的化学成分入手，分析了包括羰基—CO、亚甲基—CH2—、巯基—SH、氨基—NH2等多种官能团的拉曼特征振动频率，并对光谱曲线中出现的特殊结构（如椅形结构）进行理论分析和解释。然后针对细胞组成的两大成分蛋白质和遗传物质的结构构像进行相应的拉曼光谱分析。在蛋白质分析过程中，分析酪胺酸中埋藏的和暴露的残基的比例关系，分析C—C单键伸缩振动的α-螺旋、β-折叠、β-回折和无规卷曲方面的信息，同时着重对于氨基酸缩合肽键的酰胺Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ谱线进行较为细致的分析。遗传物质是每个生物体所具有重要结构，本研究针对核小体以及组成DNA的脱氧核苷酸进行构型分析，同时也分析了RNA的骨架磷酸基团的特征拉曼谱线；并总结得出水稻叶片中的腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶的多个对应谱峰。针

对糖蛋白和糖脂的重要组成成分，分析了碳水化合物中葡萄糖、D-甘露糖、葡萄糖醛酸、N-乙酰基葡萄糖等4种构象的拉曼特征谱线。由于植物细胞的结构复杂程度不可能将立体结构完全进行构象分析，所以通过水稻叶片中各种部分的二级结构构象分析，实现了水稻叶片半定量分析的目的，为今后拉曼光谱检测寒地水稻病害对比分析提供了理论基础。

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