安荣韩佩玉徐秋颖丁维俊孔维

成都中医药大学(成都 610075)



痛泻要方对肠易激综合征模型大鼠肠道高敏感性及海马区c-Fos表达的影响*

安荣▲韩佩玉△◇徐秋颖丁维俊孔维◆

成都中医药大学(成都 610075)

摘要目的：观察痛泻要方对肠易激综合征模型大鼠结肠运动及海马区c-Fos表达的影响，探讨c-Fos在IBS发病中的作用机制。方法：采用慢性轻度不可预见性应激联合高糖高脂饲料、高温高湿环境加酒精刺激，建立IBS大鼠模型，应用痛泻要方干预，双歧杆菌作为阳性药物对照。观察大鼠一般情况、体重、肠道敏感性变化，连续治疗3周后,采用免疫组化法检测海马区c-Fos表达情况。结果：与正常组比较，IBS模型组大鼠精神萎靡，体重明显降低、肠道敏感性升高、海马区c-Fos阳性细胞率增加(P<0.01)。与模型组比较，痛泻要方组、双歧杆菌组大鼠精神好转、体重增加、肠道敏感性降低，海马区c-Fos阳性细胞率降低(P<0.05或P<0.01)。两治疗组比较无显著差异。结论：c-Fos的表达与IBS的内脏敏感性有一定的联系，痛泻要方可能通过调节中枢c-Fos表达，从而改善肠道高敏感性，治疗IBS。

主题词肠易激综合征/中医药疗法 痛泻要方/治疗应用 体重变化 @c-Fos 动物实验 大鼠

肠易激综合征(Irritable bowel syndrome, IBS)是一种持续或间歇发作的腹痛、腹胀、排便行为和大便性状异常，而缺乏胃肠道结构改变和生化异常依据的慢性肠道功能紊乱性疾病。我国IBS发病率为5%～12%[1]，欧美地区据报道为10%～20%[2-4]。其发病原因复杂，可能与胃肠道动力障碍、内脏感觉过敏、脑肠轴紊乱、肠道菌群失调、肠道炎症和免疫反应、精神心理因素、遗传等多种因素有关。其中内脏感觉过敏作为IBS重要病因和病理生理特征之一，被认为是腹部不适感觉的主要机制，可能是由内脏感觉通路异常或脑肠轴调节紊乱造成的。脑肠肽c-Fos作为神经元激活的标志物，在IBS的发病中起着重要作用。中药复方痛泻要方由炒白术、炒白芍、防风、陈皮四味中药配伍而成，具有补脾柔肝，祛湿止泻等功效，适用于IBS。本实验采用慢性轻度不可预见性应激联合高糖高脂饲料、高温高湿环境加酒精刺激，建立IBS大鼠模型，应用痛泻要方干预，观察各组大鼠结肠运动功能各项指标及海马区c-Fos表达情况，初步探讨其可能作用机制。

1实验材料1.1动物8周龄SPF级SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠40只，体重180～210g，购于成都达硕实验动物有限公司，合格证号：SCXK(川)2013-24。饲养于成都中医药大学十二桥校区中医眼科实验中心动物房独立换气系统笼具(IVC)，每笼5只，每3d更换垫料，清洗、消毒笼具。室温22～27℃，湿度50～70%，昼夜节律控制为12/12h(8:00开灯，20:00关灯)。

1.2药物与试剂中药痛泻要方免煎颗粒江阴天江药业有限公司生产，组成如下：炒白术3g/袋，相当饮片10g，批号1401089；炒白芍1g/袋，相当饮片10g，批号1312078；防风1g/袋，相当饮片6g，批号1401089；陈皮1g/袋，相当饮片6g，批号1401089，临用前将以上四种药各取1袋混合，以6g∶12mL蒸馏水溶解充分予以灌胃。双歧杆菌活菌胶囊购于四川大药房，由丽珠医药生产(丽珠肠乐)，每粒含0.5亿活菌，批号20131135，4℃ 冰箱中保存备用。临用前每粒以10mL蒸馏水混匀予以灌胃。兔抗大鼠c-Fos多克隆抗体(一抗)，编号ab53036，abcam公司生产。免疫组化染色试剂盒SP-9001，北京中杉金桥生产。

1.3主要仪器8Fr(3mm)双腔儿童型末端带气囊导尿管，Leica EG 1160包埋机，Leica RM 2245轮转式切片机，Leica HI 1220 烘片机，OlympusBX51光学显微镜。

2实验方法2.1动物分组普通饲料适应性饲养1周，按照体重随机将40只SD大鼠分为正常对照(N)组、模型对照(M)组、痛泻要方(T)组、双歧杆菌(B)组，每组10只。

2.2IBS模型建立IBC正常对照组以普通饲料喂养，其余各组完成两方面造模： 脾胃湿热泄泻造模：以高糖高脂饲料喂养。造模第8天将大鼠每天放入自制造模箱高温高湿环境(温度32±2℃，相对湿度90±5%)2h。从第15天开始灌胃红星二锅头(酒精度56%)，剂量7mL/kg，1次/d，共7d。 慢性轻度不可预见性应激造模：随机给予①禁食24h；②禁水24h；③45℃环境5min；④夹尾1min：用止血钳夹住距离尾尖1cm处，力度使动物发出哀叫声即可，持续1 min；⑤4℃冰水游泳3min；⑥12h～12h昼夜颠倒；⑦水平振荡(150次/min)45 min。每日随机给予大鼠以上刺激的1种处理，每7d为1个周期，且任何连续2d的刺激均不相同，使大鼠不能预见发生何种刺激，共持续3周。

2.3给药及方法T组给予痛泻要方颗粒混悬液4mL/kg·d灌胃；B组给予双歧杆菌混悬液5×106CFU/mL以4mL/kg·d灌胃；N组、M组均给予生理盐水4mL/kg·d灌胃。连续3周。

2.4指标测定2.4.1体重测定：每周测定体重1次。

2.4.2痛阈测定：分别于造模前、造模后、干预后测定，大鼠禁食不禁水12 h，乙醚麻醉后，将8Fr(3mL)双腔儿童型末端带气囊导尿管外涂石蜡油后插入肛门，使气囊近端距肛门1 cm。将肛门外导尿管用胶带从鼠尾近端开始固定，每隔2 cm处同样方法固定，导管与注射器相连。将大鼠固定于透明塑料盒中，使其不能前后移动、翻转，待大鼠苏醒适应环境后, 注射器慢慢向球囊内注入常温水扩张，观察腹部收缩反射(Abdominal withdrawal reflex,AWR)，记录引起大鼠腹背部肌肉轻微收缩但腹部未抬离地面时的最小注水量，重复扩张 3 次, 每次间隔 5 min, 取3 次扩张测得的最小注水量的均值代表痛阈，评价大鼠对直肠内扩张刺激的敏感性。

2.4.3免疫组化法测定海马区c-Fos表达：以10%水合氯醛30mL/kg行腹腔注射麻醉，开胸分别以生理盐水、10%的甲醛经心脏灌洗后，迅速取出大脑，放入10%的甲醛中固定。取视交叉后4mm处至小脑前的脑组织常规石蜡包埋，4μm厚度切片，贴附于涂有多聚赖氨酸的玻片备用。采用免疫组化链霉菌抗生素蛋白-过氧化物酶(S-P)法测定大鼠大脑海马区c-Fos表达。光镜下以细胞内出现黄色、棕色、棕褐色颗粒为c-Fos阳性表达。观察c-Fos免疫组化染色细胞阳性率，在200倍视野下选择海马同一区域记录染色阳性细胞数，取其平均数。

3实验结果3.1一般情况整个实验期间，无大鼠死亡现象。正常对照组大鼠反应灵敏，精神状态良好，饮食、大便正常，毛发顺滑有光泽，造模后各组大鼠精神萎靡，易激惹，弓背，倦怠蜷卧，反应迟钝，活动减少，食欲减低，出现不同程度稀便，体重增长缓慢或略有下降，毛发发黄、污秽、缺少光泽，肛周夹有粘液或体毛被稀便沾染。经药物治疗后各组大鼠上述表现均较模型组有明显好转。

3.2痛泻要方对IBS大鼠体重的影响见表1。

大鼠实验期间，正常对照组大鼠体重呈稳定的上升趋势，而造模各组大鼠体重增长缓慢。与正常对照组比较，自造模第2周起，造模各组大鼠体重明显开始低于正常组(P<0.01)，说明造模造成大鼠食欲减低，腹泻出现导致体重增长缓慢。治疗后，用药组大鼠体重增长高于模型对照组，与模型对照组比较，自用药2周起，痛泻要方组、双歧杆菌组大鼠体重增长明显高于模型对照组(P<0.05或P<0.01)，说明痛泻要方、双歧杆菌治疗IBS大鼠腹泻效果明显。痛泻要方组与双歧杆菌组比较，大鼠体重增长没有明显差异(P>0.05),说明两者治疗大鼠腹泻效果相当。

表1　痛泻要方对IBS大鼠体重的影响

注：与正常对照(N)组比较， ▲P<0.01；与模型对照组(T)比较，◇P<0.05，◆P<0.01

3.3痛泻要方对IBS大鼠肠道痛阈的影响见表2。

造模后各组大鼠引起疼痛的直肠球囊最小注水量明显低于正常对照组(P<0.01)，说明造模后大鼠肠道敏感性增高，痛阈降低。治疗3周后，模型对照组、痛泻要方组大鼠直肠球囊最小注水量明显低于正常对照组(P<0.05或P<0.01)；与模型对照组比较，痛泻要方组、双歧杆菌组大鼠直肠球囊最小注水量明显增加(P<0.05或P<0.01)，说明其治疗有助于降低肠道敏感性，痛阈升高；与双歧杆菌组比较，痛泻要方组大鼠直肠球囊最小注水量无明显变化(P>0.05),说明两者降低肠道敏感性效果相当。

表2　痛泻要方对IBS大鼠肠道痛

注：与正常对照(N)组比较，△P<0.05, ▲P<0.01；与模型对照组(T)比较，◇P<0.05，◆P<0.01

3.4痛泻要方对IBS大鼠海马区c-Fos的影响见表3、图1。治疗3周后，与正常组对照比较，模型对照组、痛泻要方组、双歧杆菌组大鼠海马区c-Fos阳性细胞率均明显升高(P<0.01)；与模型对照组比较，痛泻要方组、双歧杆菌组大鼠海马区c-Fos阳性细胞率均明显降低(P<0.01)，说明两者均有一定降低海马区c-Fos阳性细胞率的作用；两治疗组比较，大鼠海马区c-Fos阳性细胞率无明显变化(P>0.05),说明两者降低海马区c-Fos表达的作用相当。

表3　痛泻要方对IBS大鼠海马区

注：与正常对照(N)组比较，∆P<0.01；与模型对照组(T)比较，▲P<0.01

图1　各组大鼠海马区c-Fos阳性细胞表达情况

4讨论中医学将IBS归为“腹痛”、“泄泻”、“便秘”、“郁证”等范畴；认为本病由饮食不节、感受外邪、内伤七情、劳役禀赋等原因，导致肝脾失调，脾运失常，肝气郁结，进而横逆乘脾，致脾胃升降失调，气机逆乱，出现腹痛、泄泻等症状[5]。IBS主要证型有脾虚湿阻、肝郁脾虚、脾肾阳虚、脾胃湿热、肝郁气滞及肠道燥热证[5-7]。肝郁脾虚是IBS核心病机，肝失疏泄是IBS 重要成因，脾胃升降失调是IBS发生的直接原因。痛泻要方由白术、白芍、陈皮、防风组成，方中白术苦温，补脾燥湿，为君药；白芍酸寒，柔肝缓急止痛，与白术配伍，为臣药；陈皮辛苦而温，理气燥湿，醒脾和胃，为佐药；防风燥湿以助止泻，为脾经引经药，故为佐使药。全方抓住IBS核心病机，适合于腹泻型IBS,临床疗效良好。

西医认为IBS病因复杂，但多数学者认为脑肠轴调控紊乱是IBS的重要病理基础。而脑肠肽将肠神经和中枢神经联系起来，调控肠道运动、感觉和内分泌功能，研究较多的脑肠肽包括5-羟色胺(5-HT)、血管活性肠肽(VIP)、胆囊收缩素(CCK)、P物质(SP)、c-Fos等，其中c-Fos是c-fos基因表达核蛋白，c-fos是即刻早期基因(Immediate early genes,IEGs)的一种表达蛋白，IEGs是在细胞受到刺激时最先表达的一组基因，c-fos的功能是通过c-Fos实现的，近年来作为神经元激活的标志物用于神经元通路的研究。研究表明，c-fos基因可被多种刺激如缺氧、疼痛刺激、机械刺激、慢性心理刺激、光线刺激等诱导在中枢海马、大脑皮质、纹状体快速表达，其中以海马表达最为密集[8-12]，说明c-fos是调控心理应激反应和抗应激损伤的作用靶点之一。IBS因为内脏高敏感性引起的腹痛、腹泻、腹胀等刺激，使中枢c-fos基因处于高表达状态。研究表明[13]c-fos的表达与IBS的内脏敏感性和肠道运动有一定的联系，肠神经丛初级感觉神经元的激活是IBS内脏高敏感的机制之一。

本实验采用联合造模方法建立脾胃湿热泄泻型IBS大鼠模型，免疫组化方法检测各组大鼠海马区c-Fos的阳性表达，结果显示，模型组大鼠海马区c-Fos的阳性细胞表达率较正常组显著增高，说明脾胃湿热泄泻型IBS模型大鼠体内存在c-Fos水平升高的病理状态，经治疗后，痛泻要方组、双歧杆菌组大鼠海马区c-Fos较模型组显著降低。同时本实验检测了各组大鼠肠道敏感性的变化，模型组较正常组痛阈明显降低，肠道敏感性升高，经治疗后，痛泻要方组、双歧杆菌组较模型组痛阈明显升高，肠道敏感性降低。由此我们推测：应激反应诱导中枢c-fos表达量增加，产生的c-Fos升高可能使大鼠对应激的反应能力增强，通过脑-肠轴传递，引起肠道敏感性增高、胃肠运动亢进，从而产生腹痛、腹泻、腹胀等肠道症状，痛泻要方可能通过降低中枢c-fos基因的表达从而产生治疗腹泻型IBS的作用。

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(收稿2016-01-09；修回2016-02-13)

【中图分类号】R259

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.05.046

*国家自然科学基金资助项目(81303087)

▲陕西中医药大学(咸阳 712046)

◇西南民族大学(成都 610041)

◆陕西省咸阳市第一人民医院(咸阳712000)

△通讯作者

·实验研究·