李　频

四川自贡市中医医院药剂科(自贡　 643010)



高效液相色谱法同时测定香青兰中熊果酸和齐墩果酸含量

李频

四川自贡市中医医院药剂科(自贡 643010)

摘要目的：建立药材香青兰中熊果酸和齐墩果酸HPLC含量同时测定方法。方法：ZORBAX C18色谱柱(4.6mm×250mm，5um)，检测波长：220nm，流速：0.6mL/min，柱温：25℃，流动相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(85∶15∶0.04∶0.08)。结果：所测成分熊果酸进样量在0.1017μg～2.5425μg(r=0.9994)范围内与峰面积呈良好线性关系；齐墩果酸进样量在0.3063μg～7.6575μg(r=0.9996)范围内与峰面积呈良好线性关系。加样回收率分别是98.07%(RSD=0.66%)和99.41%(RSD=1.02%)。结论：本文所采取的方法准确可靠，适用于香青兰中熊果酸和齐墩果酸的含量的同时测定。

主题词熊果酸/中药分析化学 齐墩果酸/中药分析化学色谱法, 高压液相@香青兰

香青兰为唇形科植物香青兰的干燥地上部分[1]，维吾尔名为巴德兰吉布牙香青兰[2](Dracocephslum moldavicae L.)，是维吾尔族、蒙古族习用药材，属于豆属豆科菜一年生草本，茎叶带有芳香味[3]。香青兰有安神补脑、暖胃养肝、止喘镇咳等作用，一般用于心脏性的脑病、高血压引起的头昏、气管炎等，《后续医典》中治疗肝热的七味清肝红花散中就加有此味药材，其对胃出血也有良好治疗效果，在《蒙医药方汇编》记载中七味松石散就加有此药治疗胃出血。近些年有学者研究发现此药中含有许多化合物如：黄酮类、氨基酸、木脂素类、萜类、黄酮醇类等[4-6]。

虽香青兰在中药治疗中使用广泛，近些年有不少学者对其有进一步研究，但目前对其含量测定方面报导特别是同时测定的报导并不多见。本文所研究的熊果酸和齐墩果酸属于三萜类的化合物，此类物质对肝损伤有一定的保护作用，还具有抗菌、抗炎、抗病毒和抗肿瘤的活性。本文在参考许多前期文献基础上[7-9]，利用高效液相色谱，可以让样品进行简单的处理，对香草兰有效成分熊果酸和齐墩果酸进行同时测定，以期为香青兰中含量测定及其日后的质量控制提供一定参考价值。

1检测仪器与材料仪器：美国Walters高效液相色谱仪，包括Walters1520泵，Walters2485双波长检测器，Walters726自动进样器、Empower色谱工作站。药材：药材采自内蒙古自治区小井沟、南天门、蛮汉山。由中药材专家鉴定所得药材均为唇形科青兰属植物香青兰。

熊果酸和齐墩果酸的对照品(批号：200928-120742,200704-120709，中国药品生物制品检定所)；甲醇为色谱纯，水为二次蒸馏水，其余试剂均为分析级。

2色谱条件ZORBAX C18色谱柱(4.6mm×250mm，5um)，检测波长：220nm；流速：0.6mL/min,；流动相：甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90∶10∶0.04∶0.07)；柱温: 25℃。进样量10μL；可以看到此条件下，样品峰的分离度良好。

图1　香青兰高效液相色谱图

3溶液的配制3.1样品配置方法将获得的不同时期香青兰粉碎，选用40目将粉末进行过筛并进行精密称定1.000g(误差不大于10%),于索氏提取器中，加入丙酮100mL，加热回流约4h～5h，之后将丙酮转移至蒸发皿中蒸干，用石油醚将残渣浸润2次～3次，每次10mL；2min～4min后，弃石油醚上层，用醇定容至5mL，震荡摇匀，用滤纸过滤，即得到供试品溶液。

3.2对照品溶液的配制精密称取对照品齐墩果酸10.17mg，加甲醇定容于10mL容量瓶中，之后精密吸出1mL于另10mL容量瓶，定容至刻度，待用(0.1017mg/mL)；精密称取熊果酸对照品10.21mg，加醇定容至10mL，之后精密吸取3mL于另10mL容量瓶，定容至刻度，待用(0.3063 mg/mL)。

4方法学考察4.1线性关系考察按照上面所描述的色谱条件,分别取对照品的熊果酸、齐墩果酸溶液(1μL，5μL，10μL，15μL，20μL，25μL)进行测定制表，横坐标为齐墩果酸溶液、熊果酸进样量，将峰面积为纵坐标，对所得的数据进行分析,得出回归方程分别为：熊果酸溶液，回归方程为Y=341768X-207594(r=0.9994)，在0.1017μg～2.5425μg范围内与峰面积呈良好线性关系；齐墩果酸溶液，回归方程为Y=297814X-39645.70(r=0.9996)，在0.3063μg～7.6575μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

4.2稳定性实验取同一份供试品溶液，室温放置，以时间间隔为1h，3h，5h，7h，9h，吸取样品进行测定，测得熊果酸的峰面积分别2044631, 2047677, 2045586,2053796, 2046990，RSD计算为2.09%；测得齐墩果酸的峰面积为609237, 600863, 603947, 608810，608139，RSD为1.07%。结果显示，该实验测定方法稳定性符合要求。

4.3精密度实验精密吸取样品溶液10μL，连续进样5次，得到熊果酸的峰面积分别为2057440，2049109,2048422，2046631,2049103，RSD为0.79%；齐墩果酸的峰面积分别为603303，602562,602825，603279,603729，RSD结果为1.04%，表明此次制作精密度符合标准。

4.4重复性实验对同批样品进行精密称取1.000g(误差不大于10%)，将100mL丙酮加入索氏提取器中，进行4h～5h的加热回流，将加热回流后所得丙酮转至蒸发皿中晾干，每次对残渣用10mL石油醚进行浸润并重复操作1～2次，每次浸润时间为2min～4min，将石油醚上层溶液分离后用醇定容至5mL，震荡摇匀，用滤纸过滤，得到供试品溶液后，进样10μL进行测定。熊果酸的含量分别为1.285mg/g，1.259 mg/g，1.278 mg/g，1.288 mg/g，1.291mg/g，1.281 mg/g，RSD为0.89%；齐墩果酸的含量分别为0.465 mg/g，0.453 mg/g，0.452 mg/g，0.449 mg/g，0.461 mg/g，0.457 mg/g，RSD为1.32%。结果表明重复性检验方法准确度良好。

4.5回收率实验对同批样品进行精密称取0.5000g(误差不大于10%),共6份，再分别加入熊果酸和齐墩果酸对照品溶液0.8mL，1.0mL，1.2mL；取本品粉末精密称定1.000g(误差不大于10%), 将100mL丙酮加入索氏提取器中，进行4h～5h的加热回流，将加热回流后所得丙酮转至蒸发皿中晾干，每次对残渣用10mL石油醚进行浸润并重复操作1～2次，每次浸润时间为2min～4min，弃石油醚上层，用醇定容至5mL，震荡摇匀，用滤纸过滤，得到供试品溶液，并且按照含量测定方法进行测定，得出熊果酸的平均回收率为97.12%，RSD为1.02%；齐墩果酸的平均回收率97.28%为，RSD为0.97%。结果表明准确度良好(见表1)。

表1　回收率测定结果

5样品含量测定取本品粉末3批(2012-0801、2012-0802、2012-0803)，精密称定1.000g(误差不大于10%), 将100mL丙酮加入索氏提取器中，进行4h～5h的加热回流，将加热回流后所得丙酮转至蒸发皿中晾干，每次对残渣用10mL石油醚进行浸润并重复操作1～2次，每次浸润时间为2min～4min，将石油醚上层溶液分离后用醇定容至5mL，震荡摇匀，用滤纸过滤，得到供试品溶液。用HPLC方法进行含量测定，结果见表2。

表2　香青兰中齐墩果酸、熊果酸的含量比例

6讨论6.1选择药品提取检测成分齐墩果酸、熊果酸为非极性化学成分，其在乙醇、氯仿、丙酮等有机溶剂中有较好的溶解性，在水和石油醚中溶解性差。根据检测成分的化学性质，我们对检测成分的提取设计了以下几种方式：①乙醇超声提取，②乙醚索氏提取，③ 甲醇索氏提取，④三氯甲烷超声提取，⑤丙酮超声提取。结果显示索氏提取的含量较其他方式检测成分提取含量较高，且采用乙醚提取高于甲醇，故此采取了乙醚索氏提取,提取时间选择为4h～6h，由于4h已基本提取完全，为了节约成本，最终选择4h。

6.2流动相的选择本实验中所采取的流动相我们采用了，甲醇/水体系，甲醇/水/冰醋酸体系，以及甲醇/水/冰醋酸/三乙胺体系，最终确定为甲醇-水-冰醋酸-三乙胺(90∶10∶0.04∶0.08), 该体系下物质各成分分离度和峰形均较好。

6.3流速的选择本实验中采用的流速是0.6mL/min，预实验时，尝试了两种流速：0.6mL/min和 1mL/min，结果发现采用0.6mL/min的流速可有效对物质进行分离，且对保留时间无明显影响，因此本次实验中选择的流速为0.6mL/min。

6.4检测波长的选择波长小于200nm的时候，发现信噪比小，定量难度大；波长大于230nm的时候，发现响应值低，最终选择波长为220nm,此时两个检测物质能很好分开，待测物质相应高，且杂质相应较低。

参考文献

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[3]买买提·努尔艾合提,吐尔洪·艾买尔,罗光明.高效液相色谱法测定维吾尔药材香青兰中田蓟苷和洋芹素的含量[J].中国民族医药杂志,2009,14(11):61-62.

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(收稿2015-12-24；修回2016-01-12)

Simultaneous determination of ursolic acid and oleanic acid in dracocephalum moldavicum L by

HPLC Department of Pharmacy, Traditional Chinese Medicine Hospital of Zigong(Zigong 643010)

Li Pin

ABSTRACTObjective: To establish method to simultaneous determination the content of ursolic acid and oleanic acid in dracocephalum moldavicum L. Methods: HPLC was carry out on a ZORBAX C18 column (4.6×250 mm, 5um) with mobile phase methanol - water - acetic acid - triethylamine (85∶15∶0.04∶0.08), using flow rate of 0.6 mL/min, the column temperathre was set at 25℃, the detection wavelength was at 220 nm. Results: The linear range of Ursolic acid was 0.1017μg～2.5425μg(r=0.9994), the linear range of oleanic acid was 0.3063μg～7.6575μg(r=0.9996), within this range the linear relationship was good. The average recoveries were 97.12%(RSD=1.02%)and 97.28%(RSD=0.97%), respectively .Conclusion: This method is rapid，accurate and reliable; It could be used to simul taneous determine the content of ursolic acid and oleanolic acid in dracocephalum moldavicum L.

KEY WORDSUrsolic acid/analytical chemistry (TCD)Oleanolic acid/analytical chemistry (TCD)Chromatography, high pressure liquid@Xiangqing Lan

【中图分类号】R283

【文献标识码】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7369.2016.05.045