于　瑞，王幼平，崔　琳，李　彬，王新陆，谢世阳，高　原，朱明军

河南中医学院第一附属医院(郑州 450000)



转化生长因子β1对心肌成纤维细胞增殖及胶原分泌的影响

于瑞，王幼平，崔琳，李彬，王新陆，谢世阳，高原，朱明军

河南中医学院第一附属医院(郑州 450000)

摘要：目的探讨转化生长因子β1(TGF-β1)对原代培养的乳鼠心肌成纤维细胞(CFs)增殖与胶原合成的影响。方法出生1 d～3 d的SD大鼠，用胰蛋白酶消化、差速贴壁法分离培养乳鼠心肌成纤维细胞，用不同浓度的TGF-β1作用于心肌成纤维细胞，采用四氮唑盐(MTT)法测定CFs增殖，羟脯氨酸试剂盒检测胶原分泌，蛋白印迹法(Western Blot)检测心肌成纤维细胞分泌的TGF-β1蛋白表达。结果与正常对照组比较，10 ng/mL TGF-β1组心肌成纤维细胞增殖明显(P<0.05)；心肌成纤维细胞羟脯氨酸含量明显增加(P<0.01)，同时TGF-β1蛋白表达明显增加(P<0.05)。结论TGF-β1可引起心肌成纤维细胞的增殖，胶原分泌增加，同时可使蛋白TGF-β1蛋白含量增加。

关键词：转化生长因子β1；原代培养；心肌成纤维细胞；细胞增殖；胶原合成

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是各种病因所致持续性心肌损伤的病理性改变，主要表现为细胞增殖、胶原合成分泌过量[1]。MF不仅是各种心脏疾病发展到一定阶段的病理产物，同时也是各种心脏疾病的诱因，如心力衰竭、恶性心律失常和心源性猝死等。有效的防治心肌纤维化的发生，对降低心血管疾病死亡率、改善心脏病病人生活质量有着极其重要的临床意义。中医药对于心肌纤维化的治疗具有多靶点、多层次、副反应小、经济费用低等独特优势，近年来中药复方及其有效成分对心肌纤维化的研究已成为热点。

转化生长因子β1(TGF-β1)是目前已知的与组织纤维化的发生关系最密切的生长因子。尤其在心脏重塑机制中起着至关重要的作用[2]。有研究证明[3]，TGF-β1在心肌缺血早期可以诱导单核细胞趋化以及淋巴细胞的浸润，同时调控炎症因子及氧化应激反应，使局部存活的心肌细胞肥厚，影响内皮细胞功能，其次TGF-β1诱导心肌成纤维细胞向肌成纤维细胞的转化，进一步促进胶原蛋白沉积并抑制其降解。针对心血管系统，TGF-β1可产生以下影响：①调节成纤维细胞的表型转化，增加胶原蛋白分泌，促进纤维化；②抑制基质金属蛋白酶(MMPs)的活性和诱导合成蛋白酶抑制物，阻滞细胞外基质(ECM)的降解[4]；③参与β-肾上腺素介导的心肌重构[5]。总之，TGF-β1能诱导心肌成纤维细胞(cardiac fibroblasts，CFs)增殖，转分化为肌成纤维细胞，同时刺激胶原蛋白、纤维联结蛋白及蛋白多糖等细胞间质成分的合成，促进细胞间质的沉积。

本研究主要探讨TGF-β1对原代培养的心肌成纤维细胞增殖以及胶原分泌合成的影响，为进一步建立离体心肌成纤维细胞纤维化模型，中药或其有效成分防治心肌纤维化的研究奠定基础。

1材料与方法

1.1实验动物出生1 d～3 d的SD大鼠，雌雄不限，购于河南省动物实验中心，许可证号：SCXK(豫)2010-0002，动物合格证号：41003100001896。

1.2主要实验仪器RCO-3000TVBB型二氧化碳培养箱(美国REVCD公司)，Milli-Q Synthesis 超纯水仪(美国Milipore公司)，Spetra Max M3酶标仪(美国Molecular Devices公司)，-70 ℃低温冰箱(美国Thermo公司)，BCM-1300生物洁净工作台(苏净集团安泰公司)。

1.3试剂TGF-β1(PeproTech公司)，胎牛血清(以色列BI公司)，DMEM高糖、0.25%胰蛋白酶液、四氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)均购自北京Solarbio科技有限公司，羟脯氨酸试剂盒(南京建成科技有限公司)，TGF-β1一抗、GAPDH一抗(Abcam公司)，TGF-β1二抗、GAPDH二抗均购自Santa Cruz公司，其他试剂均为市售分析纯。

1.4方法

1.4.1新生SD大鼠心肌成纤维细胞提取及培养出生1 d～3 d的SD大鼠，在无菌条件下取出心脏，沿房室分离部位剪去心房，留下心室，并仔细去除心底部结缔组织及血管，置于4 ℃预冷的PBS溶液中，洗涤3次，用眼科剪剪成1 mm3大小的组织块。加入心肌细胞消化液15 mL，置于37 ℃恒温磁力搅拌器(速率40 r/min～60 r/min)中消化，每次8 min，至组织块变为无色透明终止消化。弃去首次消化的上清，从第2次开始收集，加入等量含10%胎牛血清的DMEM高糖培养液终止消化。1 000 r/min离心10 min，弃上清，加入1 mL含10%胎牛血清的DMEM培养液轻轻吹打混匀，制成细胞悬液，置于200目筛网过滤。收集细胞悬液于培养瓶中，37 ℃、5%CO2培养箱中差速贴壁90 min，贴壁的细胞即为心肌成纤维细胞。待细胞成长接近融合时按1∶2传代培养，本实验采用第2代～4代细胞进行实验。

1.4.2MTT法检测TGF-β1对CFs增殖的影响取处于对数生长期的心肌成纤维细胞，密度调至5×104/mL接种于96孔板中，每孔加入100 μL细胞悬液，同时设有空白对照组(未接种细胞)，细胞培养24 h，饥饿12 h，使细胞处于同一生长周期。分为3组：正常对照组、1 ng/mL TGF-β1组、10 ng/mL TGF-β1组。加入含或不含TGF-β1的培养液继续孵育24 h，每孔加入含5 mg/mL MTT的DMEM培养液100 μL，避光孵育4 h，小心吸取上清，每孔加入二甲基亚砜100 μL，震荡10 min，使蓝紫色结晶充分溶解。用酶标仪检测各孔细胞490 nm波长处吸光度值。

1.4.3羟脯氨酸试剂盒检测细胞上清液胶原含量取处于对数生长期的心肌成纤维细胞，密度调至5×104/mL接种于6孔板中，每孔接种1 mL细胞悬液，培养24 h后，饥饿12 h。分为两组：正常对照组、10 ng/mL TGF-β1组。加入或未加入TGF-β1孵育24 h，收集上清于1.5 mL EP管中。按照羟脯氨酸试剂盒(消化法)说明书步骤操作，用酶标仪检测各组上清550 nm处吸光度值。

1.4.4Western blot检测心肌成纤维细胞TGF-β1蛋白含量将心肌成纤维细胞调至5×105/mL接种于6孔板中，每孔接种1 mL细胞悬液，培养24 h后，饥饿12 h。分为两组：正常对照组、10 ng/mL TGF-β1组。加入或未加入TGF-β1孵育24 h，收集各组蛋白。置于4 ℃预冷的冰上，加入细胞裂解液裂解细胞，4℃ 120 000 r/min离心15 min，收集上清于-70 ℃冰箱冻存。将提取的细胞蛋白定50 μg，通过 SDS-PAGE 电泳跑胶分离，半干转移法行PVDF转膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，分别加入TGF-β1、GAPDH一抗4 ℃过夜，TBST洗膜，后置于37 ℃恒温摇床孵育二抗1 h，TBST洗膜。ECL化学发光法暗室曝片。蛋白条带采用Image J软件分析，测定其灰度值。

2结果

2.1心肌成纤维细胞形态倒置显微镜下观察，心肌成纤维细胞呈梭形或不规则的多边形，排列紧密，胞质透明，胞核较大，呈椭圆形，轮廓清楚，细胞间可重叠交叉生长。心肌成纤维细胞形态见图1。

图1　心肌成纤维细胞

2.2TGF-β1诱导心肌成纤维细胞增殖的影响与正常对照组比较，1 ng/mL TGF-β1组、10 ng/mL TGF-β1组吸光度值均有升高趋势。1 ng/mL TGF-β1组较正常对照组稍有增加(P>0.05)；10 ng/mL TGF-β1组增加显著，差异有统计学意义(P<0.05)。详见表1。

表1　TGF-β1诱导对心肌CFs

2.3TGF-β1对心肌成纤维细胞羟脯氨酸含量的影响10 ng/mL TGF-β1组较正常对照组比较，吸光度值含量增加明显，差异有统计学意义(P<0.01)。详见表2。

表2　TGF-β1对心肌成纤维细胞羟脯氨酸含量的影响(±s)

2.4TGF-β1对心肌成纤维细胞蛋白TGF-β1含量的影响与正常对照组比较，10 ng/mL TGF-β1组蛋白含量显著增加，差异有统计学意义(P<0.05)。详见图2。

注：与正常对照组比较，﹟P<0.05。

图2TGF-β1对心肌成纤维细胞分泌TGF-β1蛋白的影响

3讨论

近年来大量研究表明，心肌纤维化与多种心血管疾病具有相关性，如高血压病、心肌梗死、心力衰竭、风湿性心脏病等。同时MF是多种心血管系统疾病发展到一定阶段的共同病理性改变，心室重构是其主要的病例特征，尤其表现在心肌僵硬度增加，心肌收缩力下降，冠脉血流储备降低方面，甚则引起恶性心律失常和猝死，其危害性不容忽视。近年来，探讨心肌纤维化的详细发病机制，以及中药复方、单味药在干预心肌纤维化的作用成为热点[6]。结合心肌成纤维细胞的增殖及胶原蛋白合成分泌增加是MF的细胞生物学基础，所以药物对体外CFs的抑制作用成为评价药物防治MF的重要指标之一[7]。

TGF-β1是目前研究最多的参与到纤维化机制的细胞调控因子，其作为最重要的促纤维化生长因子[8]，不仅参与了上游各种生物工程以及信号传导途径的调节，同时可以直接刺激CFs的增殖。TGF-β1通过与细胞膜表面上的受体结合，然后激活信号传导通路，发挥其生物学效应[9-10]。有研究证明[11]，肝细胞生长因子可以对TGF-β1诱导的心肌成纤维细胞的细胞增殖、胶原合成增加起到抑制作用。罗红等[12]研究证明丹酚酸B可以显著抑制TGF-β1诱导的心肌成纤维

细胞增殖，进一步为中药防治心肌纤维化提供了新的思路和靶点。

本实验结果在分子生物学的层面上证实，TGF-β1对体外培养的原代乳鼠心肌成纤维细胞的细胞增殖、胶原合成增加有促进作用，同时使蛋白TGF-β1的含量增加。进一步证实了TGF-β1在离体细胞实验心肌纤维化模型的可行性。

参考文献：

[1]束长城，魏万林.中医药逆转心肌纤维化的研究进展[J].中国循证心血管医学杂志，2011，3(1)：74-78.

[2]Bujak M，Frangogiannis NG.The role of TGF-beta signaling in myocardial infarction and cardiac remodeling[J].Cardiovasc Res，2007，74(2)：184-195.

[3]王新，王德国，赵春梅，等.转化生长因子β1对培养心脏成纤维细胞a-SMA及Cx43表达的影响[J].中国临床药理学与治疗学，2014，19(7)：738-742.

[4]Leask A.Targeting the TGF beta，endothelin-1 and CCN2 axis to combat fibrosis in scleroderma[J].Cell Signal，2008，20(8)：1409-1414.

[5]杨锦龙，范忠才.转化生长因子β1与心肌纤维化的研究进展[J].医学理论与实践，2014，27(8)：1007-1009.

[6]殷子杰，窦丽萍，崔小强.中医药抗心肌纤维化研究趋势的分析与探讨[J].心脑血管病防治，2009，9(2)：141-142.

[7]宋金燕，刘俊田，庞晓明，等.大黄蛰虫丸对异丙肾上腺素诱导大鼠心肌纤维化的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18(13)：169-172.

[8]Lian H，Ma Y，Feng J，et al.Heparin-binding EGF-Like growth factor induces heart interstitial fibrosis via an Akt/mTor/p70s6k pathway[J].PLoS One，2012，7：e44946.

[9]郭张强，廖玉华，程翔，等.心肌梗死大鼠心室重塑的动态观察[J].中国免疫学杂志，2006，22(12)：1075-1078.

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[11]Yi X，Li XY，Zhou YL，et al.Hepatocyte growth factor regulates the TGF-β1-induced proliferation，differentiation and secretory function of cardiac fibroblasts[J].International Journal of Molecular Medicine，2014，34：381-390.

[12]罗红，杨宏宇，沈祥春.丹酚酸B对转化生长因子β1诱导心肌成纤维细胞增殖的影响[J].中国药房，2014，25(3)：202-204.

(本文编辑郭怀印)

(收稿日期：2016-01-19)

中图分类号：R329.2R256.2

文献标识码：A

doi：10.3969/j.issn.1672-1349.2016.09.008

文章编号：1672-1349(2016)09-0952-03

通讯作者：朱明军，E-mail：zhumingjun317@163.com

基金项目：国家自然科学基金项目(No.81173410)；河南省高校科技创新团队支持计划(No.13IRTSTHN012)；河南省中医药防治心血管疾病创新型科技团队[No.豫科人组(2013)2号50]

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