杜娴娟　申敬伟

(安阳市肿瘤医院/河南科技大学第四附属医院 病理科　河南 安阳　455000)



2013版ASCO/CAP HER2检测指南的更新对乳腺癌HER2基因扩增状态的影响

杜娴娟申敬伟

(安阳市肿瘤医院/河南科技大学第四附属医院 病理科河南 安阳455000)

【摘要】目的比较2007版与2013版ASCO/CAP指南对乳腺癌人类表皮生长因子受体2(HER2)基因扩增状态的影响。方法对ASCO/CAP HER2检测指南更新之前的115例乳腺癌荧光原位杂交(FISH)检测样本的HER2状态进行回顾性分析，分别根据2007版与2013版指南的HER2判读标准分析其HER2基因扩增状态。结果采用FISH检测的115例样本中，根据2007版指南判定53例(46.1%)为阳性，58例(50.4%)为阴性，4例(3.5%)为不确定；根据2013版新标准重新判定55例(47.8%)为阳性，53例(46.1%)为阴性，7例(6.1%)为不确定。经χ2检验，2013版指南更新后判定为不确定的例数较2007版有显著性增长(6.1%比3.5%，P<0.001)。结论2013版指南发表的HER2判读标准结合了HER2/CEP17比值及平均HER2基因拷贝数，对一些复杂信号作出了更加明确的指示，指南更新后HER2基因扩增的不确定例数有显著性增长。

【关键词】HER2；荧光原位杂交；乳腺癌；ASCO/CAP指南

乳腺癌为女性发病第1位的恶性肿瘤，全国肿瘤登记地区2012年女性乳腺癌的发病率为42.55/10万，同期女性乳腺癌的死亡率为10.24/10万[1]。人类表皮生长因子受体2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)基因即c-erbB-2基因，是定位于人类17号染色体(Chr17)长臂(17q12)上的原癌基因，该基因在20%～30%的乳腺癌患者中有扩增或过表达[2]。经研究证实，HER2阳性的乳腺癌浸润性强，无病生存期短，预后差，其基因扩增与乳腺癌患者的复发、转移有关，且放疗、化疗效果欠佳[2-7]。正确检测和评定乳腺癌的HER2蛋白表达和基因扩增状态对乳腺癌的临床治疗和预后判断至关重要[8]。推荐采用免疫组织化学(IHC)法检测HER2受体蛋白的表达水平，应用原位杂交(in situ hybridization，ISH)法检测HER2基因扩增水平。ISH包括荧光ISH(fluorescence in situ hybridization，FISH)和亮视野ISH。常用的亮视野ISH方法有显色ISH(chromogenic in situ hybridization，CISH)[9-10]和银增强ISH(silver-enhanced in situ hybridization，SISH)[11-12]。但IHC由于其经济性，国内IHC一般作为初筛，其结果不确定时(IHC 2+)需采用FISH进一步确认[13]。由于IHC无法区分HER2蛋白为中度阳性的患者是否存在HER2基因扩增，所以直接检测HER2基因扩增水平的FISH被公认为是检测乳腺癌HER2基因扩增的“金标准”。2013年美国临床肿瘤学会/美国病理医师学院(ASCO/CAP)公布了在2007版ASCO/CAP HER2检测指南[14]基础上的更新版本[3]。本研究对115例乳腺癌FISH检测样本的HER2状态进行回顾性分析，分别根据2007版与2013版指南的HER2判读标准分析其HER2基因扩增状态，旨在探讨2013版ASCO/CAP指南的更新对HER2基因扩增状态的影响。

1资料与方法

1.1一般资料115例乳腺癌样本为2012年7月至2013年12月在安阳市肿瘤医院病理科完成的HER2基因FISH检测样本。所有乳腺癌患者均为女性，年龄27～73岁，中位年龄49岁。每例均选取石蜡包埋组织连续切片3张，厚度为3 μm。1张经HE染色确定肿瘤区域，1张用于FISH检测，1张备用，按同一组织方向捞片。

1.2仪器试剂荧光显微镜为OLYMPUS BX51，HER2/neu探针和胃蛋白酶购自广州安必平医药科技股份有限公司，HER2/CEP17(第17号染色体着丝粒)双色探针定位于17号染色体，包含红色的17q11.2-q12探针和绿色17p11.1-q11.1探针，分别用来计算平均HER2基因拷贝数和平均CEP17染色体拷贝数。

1.3实验方法FISH检测：石蜡切片于65 ℃烤片3 h。常规脱蜡，二甲苯30 min，100%乙醇脱二甲苯10 min，100%乙醇10 min，100%、85%、75%乙醇中各3 min，蒸馏水3 min，97 ℃蒸馏水煮片25 min，再于胃蛋白酶溶液中消化，2×SSC洗涤2次各5 min，过后依次经75%、85%和100%乙醇脱水各3 min后自然干燥。将探针混合液滴加于切片上，85 ℃变性5 min，37 ℃杂交过夜。第2天切片在37 ℃的2×SSC中洗10 min，过后在37 ℃的0.1% NP-40/2×SSC洗液中洗5 min，70%乙醇3 min后避光干燥，DAPI复染，封片后在荧光显微镜下观察。

1.4结果判读根据HE染色结果确定浸润性肿瘤区域，选择肿瘤细胞进行信号计数，分别由两个小组进行判读。2007版ASCO/CAP判读标准[14]：双探针HER2/CEP17比值>2.2或单探针平均HER2拷贝数/细胞>6.0判读为HER2阳性；双探针HER2/CEP17比值为1.8～2.2或单探针平均HER2拷贝数/细胞为4.0～6.0，则为结果不确定；双探针HER2/CEP17比值<1.8或单探针平均HER2拷贝数/细胞<4.0判读为HER2阴性。2013版ASCO/CAP判读标准[3]，HER2阳性为：双探针HER2/CEP17比值≥2.0，或者HER2/CEP17比值<2.0，且平均HER2拷贝数/细胞≥6.0；单探针平均HER2拷贝数/细胞≥6.0。HER2阴性为：双探针HER2/CEP17比值<2.0且平均HER2拷贝数/细胞<4.0；单探针平均HER2拷贝数/细胞<4.0。HER2结果不确定：双探针HER2/CEP17比值<2.0且平均HER2拷贝数/细胞为<6.0但≥4.0；单探针平均HER2拷贝数/细胞为<6.0但≥4.0。两版指南判读标准见表1。

1.5统计学方法应用统计学软件SPSS 11.5进行数据分析，组间比较采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

表1　2007版与2013版ASCO/CAP指南的HER2基因扩增判读标准

2结果

115例FISH检测样本经2007版与2013版指南判读结果比较见表2。其中，2007版判读不确定的有1例(0.9%)经2013版判为阳性，有2例(1.7%)判为阴性；2007版判读阴性的有1例(0.9%)经2013版判为阳性，有6例(5.2%)判为不确定。

表2　115例FISH检测样本经2007版与2013版指南

3讨论

2013版ASCO/CAP HER2检测指南的更新，从仅评估HER2/CEP17比值到同时或更加关注HER2基因拷贝数。FISH双探针检测中加入CEP17探针的目的是为了在检测HER2基因的同时，获得第17号染色体的数目，从而将第17号染色体的非整倍体和单纯的HER2基因扩增，尤其是低水平扩增区分开。但近年来的研究显示，整条第17号染色体的多体罕见，CEP17的扩增并不能代表整条第17号染色体多体。部分乳腺癌中的第17号染色体存在HER2基因和着丝粒的共同扩增。越来越多的学者认为，与HER2/CEP17比值相比，HER2拷贝数对于HER2扩增的判断可能更为重要[15]。

2013版指南把阳性标准HER2/CEP17比值从2.2降为2.0，又结合平均HER2基因拷贝数，将HER2/CEP17比值≥2.0，或HER2/CEP17比值<2.0，且平均HER2拷贝数/细胞≥6.0的样本判读为阳性。这一更新使得一部分采用2007版指南判读HER2基因扩增状态为不确定及阴性的患者获得了潜在的靶向治疗机会。本研究结果中，2007版指南判读的1例(0.9%)不确定和1例(0.9%)阴性经2013版指南判为阳性。2013指南对不确定标准也作了更新：双探针HER2/CEP17比值<2.0且平均HER2拷贝数/细胞为<6.0但≥4.0判读为不确定。本研究结果中，2007版指南判读的2例(1.7%)不确定经2013版指南判为阴性，2007版的6例(5.2%)阴性经2013版判为不确定。

采用FISH检测的115例样本中，根据2007版指南判定53例(46.1%)为阳性，58例(50.4%)为阴性，4例(3.5%)为不确定；根据2013版新标准重新判定55例(47.8%)为阳性，53例(46.1%)为阴性，7例(6.1%)为不确定。经χ2检验，2013版指南更新后判定为不确定的例数较2007版有显著性增长(P<0.001)。这与国外Sapino等[16]的大样本研究报道一致(2.4%比12.3%)。

总之，本研究简单分析了2013版ASCO/CAP HER2检测指南的更新对乳腺癌HER2基因扩增状态的影响，但限于样本量少，未进行更加详细的阐述，后续有待于扩大样本量做更加完善的分析和探讨。

参考文献

[1]赫捷,陈万青.2012中国肿瘤登记年报[M].北京:军事医学科学出版社,2012:80.

[2]Burstein H J.The distinctive nature of HER-2-positive breast cancer[J].N Engl J Med,2005,353(12):1652-1654.

[3]Wolff A C,Hammond M E,Hicks D G,et al.Recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer: American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists clinical practice guideline update[J].J Clin Oncol,2013,31(31):3997-4013.

[4]Ballinger T J,Sanders M E,Abramson V G.Current HER2 testing recommendations and clinical relevance as a predictor of response to targeted therapy[J].Clin Breast Cancer,2015,15(3):171-180.

[5]Slamon D J,Clark G M,Wong S G,et al.Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene[J].Science,1987,235(4):177-182.

[6]Yaziji H,Goldstein L C,Barry T S,et al.HER-2 testing in breast cancer using parallel tissue-based methods[J].JAMA,2004,291(12):1972-1977.

[7]Press M F,Bernstein L,Thomas P A,et al.HER-2/neu gene amplification characterized by fluorescence in situ hybridization:poor prognosis in node-negative breast carcinomas[J].J Clin Oncol,1997,15(11):2894-2904.

[8]Figueroa-Magalhães M C,Jelovac D,Connolly R M,et al.Treatment of HER2-positive breast cancer[J].Breast,2014,23(2):128-136.

[9]Hanna W M,Kwok K.Chromogenic in-situ hybridization: a viable alternative to fluorescence in-situ hybridization in the HER2 testing algorithm[J].Mod Pathol,2006,19(4):481-487.

[10]张瑰红,施达仁,梁晓曼,等.显色原位杂交和免疫组织化学检测乳腺癌HER2/neu基因状况和蛋白表达的对照性研究[J].中华病理学杂志,2006,35(10):580-583.

[11]应建明,郭蕾,刘秀云,等.全自动银增强原位杂交检测乳腺癌患者人表皮生长因子受体2基因状态[J].中华医学杂志,2010,90(24):1674-1677.

[12]Park K,Han S,Kim J Y,et al.Silver-enhanced in situ hybridization as an alternative to fluorescence in situ hybridization for assaying HER2 amplification in clinical breast cancer[J].J Breast Cancer,2011,14(4):276-282.

[13]乳腺癌HER2检测指南(2009版)编写组.乳腺癌HER2检测指南(2009版)[J].中华病理学杂志,2009,38(12):836-840.

[14]Wolff A C,Hammond M E,Schwartz J N,et al.American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for human epidermal growth factor receptor 2 testing in breast cancer[J].J Clin Oncol,2007,25(1):118-145.

[15]Viale G.Be precise! The need to consider the mechanisms for CEP17 copy number changes in breast cancer[J].J Pathol,2009,219(1):1-2.

[16]Sapino A,Maletta F,Verdun Di Cantogno L,et al.Gene status in HER2 equivocal breast carcinomas:impact of distinct recommendations and contribution of a polymerase chain reaction-based method[J].Oncologist,2014,19(11):1118-1126.

Influence of the 2013 ASCO/CAP HER2 guideline updates onHER2 FISH testing on breast cancer

Du Xianjuan, Shen Jingwei

(DepartmentofPathology,AnyangTumorHospital/theFourthAffiliatedHospitalofHenanScienceand

TechnologyUniversity,Anyang455000,China)

【Abstract】ObjectiveTo compare the influence of 2007 and 2013 ASCO/CAP HER2 guideline on HER2 FISH testing on breast cancer. MethodsWe reviewed the 115 HER2 fluorescence in situ hybridization (FISH) results of before the HER2 guidelines updates and classified them according to both the 2007 and 2013 guidelines as negative, positive, or equivocal. ResultsOf 115 HER2 FISH results, 53 (46.1%) were positive, 58 (50.4%) were negative and 4 (3.5%) were equivocal when reassessed by 2007 guidelines. Of 115 HER2 FISH results, 55 (47.8%) were positive, 53 (46.1%) were negative and 7 (6.1%) were equivocal when reassessed by 2013 guidelines. There was a significant increase in the number of HER2 FISH equivocal results after the guideline updates (6.1% vs 3.5%, P<0.001). ConclusionImplementation of the 2013 ASCO/CAP HER2 guideline updates resulted in an increase in HER2 FISH equivocal results, which can be attributed to HER2 copy number, regardless of the HER2/CEP17 ratio.

【Key words】human epidermal growth factor receptor 2; fluorescence in situ hybridization; breast cancer; ASCO/CAP HER2 guideline

(收稿日期：2015-11-23)

【中图分类号】R 743.33

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.04.010

通讯作者：申敬伟，E-mail：403555736@qq.com。