梁世霞，刘正芸，余丽梅，刘 云，郭 静，贾智诚，拓军雄，刘 杰

(1.遵义医学院 药理学教研室/贵州省教育部基础药理重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 细胞工程重点实验室，贵州 遵义 563099;3.遵义医学院 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州 遵义 563099;4.榆林市卫生学校 基础教研室，陕西 榆林 719000)

基础医学研究

六神丸和砷化合物对人肝癌Hep3B细胞增殖的影响

梁世霞1,4，刘正芸1，余丽梅2，刘 云3，郭 静4，贾智诚4，拓军雄4，刘 杰1

(1.遵义医学院 药理学教研室/贵州省教育部基础药理重点实验室，贵州 遵义 563099；2.遵义医学院 细胞工程重点实验室，贵州 遵义 563099;3.遵义医学院 贵州省普通高等学校特色药物肿瘤防治特色重点实验室，贵州 遵义 563099;4.榆林市卫生学校 基础教研室，陕西 榆林 719000)

目的 中药六神丸(LSW)含雄黄(As4S4)。近年研究表明砷化合物对血液肿瘤有显著的抑制作用，但其对实体瘤的作用报道少。故我们就六神丸和砷化合物[Na2HAsO4(As5+)、NaAsO2(As3+)、 As2O3、As4S4和As2S2]对人肝癌Hep3B细胞的抗肿瘤作用进行了研究。方法 采用MTS法检测六神丸、雄黄及其他含砷化合物对人肝癌Hep3B细胞的杀灭作用，通过原子吸收光谱测定各砷化合物中砷(As)的溶出度；流式细胞仪检测药物对细胞周期和细胞凋亡的影响；荧光定量PCR检测相关基因的表达。结果 六神丸中As的溶出度高于雄黄和As2S2,但低于亚砷酸钠(As3+)、砷酸钠(As5+)和As2O3。六神丸对Hep3B有较好的抑制增殖和杀灭作用，其作用仅次于亚砷酸钠。六神丸可诱导Hep3B细胞凋亡，作用机制与降低Bcl-2及Bcl-w的表达有关，并降低ABCG2、VEGF(血管内皮生长因子)和肿瘤转移相关基因MMP-9的表达。但六神丸对细胞周期无明显影响。结论 六神丸通过多途径对肝癌Hep3B细胞具有明显的抗增殖作用。

六神丸；抗肿瘤；Hep3B细胞；砷化合物；凋亡

六神丸(LSW)是治疗口舌糜烂、咽喉肿痛、牙痛、流行性腮腺炎等清热解毒的良方，含有13%的雄黄(As4S4)[1]。六神丸在体内对白血病、食管癌、胃癌等疗效显著[2]，在体外对人白血病HL-60细胞[3]、NB4细胞[4]、人肝癌BEL7402细胞、人胃癌SGC7901细胞[5]和人乳腺癌MCF-7细胞[6]等均有明显的抑制增殖和诱导凋亡作用。六神丸对小鼠白血病模型(L7212)[7]、H22肝癌荷瘤鼠[8-9]和S180肉瘤荷瘤鼠[10-11]有明显抑制作用，可降低其死亡率。六神丸组方中有雄黄，其抗肿瘤作用是否与As的溶出有关，目前还不清楚，其体外对Hep3B细胞的作用及机制也未见报道。因此，本实验通过体外培养法观察六神丸及其他含砷化合物对Hep3B细胞的作用及作用机制。

1 材料与方法

1.1 药品和试剂 六神丸(LSW)、雄黄购自雷允上药物有限公司；砷酸钠(Na2HAsO4，As5+)、亚砷酸钠(NaAsO2，As3+)、顺铂(Pt)、三氧化二砷(arsenic trioxide,ATO)、和二硫化二砷(As2S2)购自美国Sigma公司。所有试剂均为分析纯等级。人肝癌细胞Hep3B购自中国科学院上海生命研究院。

1.2 方法

1.2.1 MTS法检测细胞毒性 Hep3B细胞用含15%胎牛血清(FBS)的MEM培养基常规培养于5%二氧化碳的细胞培养箱中。Hep3B细胞1×105/孔(90 μL)接种于96孔板后，分别加入10 μL不同浓度 (0、0.03、0.1、0.3、1、3和10 mg/mL)的不同试药(As5+、As3+、Pt、ATO、As4S4和As2S2)，培养48 h后加入MTS液作用2.5 h，酶标仪在490 nm波长处检测其吸光度，根据吸光度值计算抑制率。

1.2.2 原子吸收法测砷溶解度 用无血清培养基溶解各含砷药物(24 h)，取上清液稀释1 000倍后上机检测As浓度，用上清液中的As浓度及各药物的含砷量计算药物的砷溶解度。

1.2.3 流式细胞术测细胞周期及其凋亡率 细胞接种12 h后用含0.5% FBS培养基处理，使其同步化，24 h后给药作用12 h，收集细胞，PBS洗3～5次。用75%酒精固定细胞，清洗，染色30 min，检测细胞周期。Annexin V-FITC/ PI双染细胞，暗室室温下孵育30 min后上机检测细胞凋亡率。

1.2.4 RT-PCR术检测抗肿瘤作用相关基因mRNA水平变化 细胞治疗24 h后用Trizol收集细胞，提取总RNA，进行逆转录。所得cDNA用荧光定量PCR扩增，所得Ct和同一标本的看家基因进行效正，设对照组为100%进行比较，引物序列见表1。

表1 PCR引物序列

基因名称GeneBank#正向引物反向引物ABCG2NM＿004827CGGGTGACTCATCCCAACATCTTAACCAAAGGCTCAGGATCTCABcl-2NM＿000633CATGTGTGTGGAGAGCGTCAAGCCGGTTCAGGTACTCAGTCABcl-wU58747GGACAAGTGCAGGAGTGGATGTCCTCACTGATGCCCAGTTGAPDHNM＿002046CCTCCCGCTTCGCTCTCTCTGGCGACGCAAAAGAAGAMMP-9NM＿004994GGACGATGCCTGCAACGTGTACTTCCCATCCTTGAACAAATACAGVEGFX62568AACACAGACTCGCGTTGCAAACCGCCTCGGCTTGTCA

2 结果

2.1 药物抑制细胞增殖的作用 MTS法检测细胞毒性(见图1)，六神丸(LSW)和三价砷(As3+)作用较强，且随浓度增大作用增强。六神丸的IC50约为0.1 mg/mL,其他砷化物的IC50分别是雄黄7.6 mg/mL(LSW的76倍),三氧化二砷(ATO)0.5 mg/mL(LSW的5倍)，As2S22.9 mg/mL(LSW的29倍)，As5+0.8 mg/mL(LSW的8倍)。六神丸体外抑制和杀灭Hep3B细胞作用与顺铂相当，甚至略强于顺铂(IC50为0.2 mg/mL)。

图为六神丸和不同砷化合物对Hep3B增殖的抑制作用的量效关系，结果为3次实验结果的平均，以IC50来评价各药的相对强度。As5+：砷酸钠；As3+：亚砷酸钠；Pt：顺铂；LSW：六神丸；ATO：三氧化二砷；As4S4：四硫化四砷，雄黄；As2S2：二硫化二砷。 图1 六神丸和相关砷化合物对Hep3B细胞增殖的抑制作用

2.2 不同含砷化合物中砷的溶解度 表2结果表明，不同含砷药物的砷溶解度差异较大。有报道称中药复方中的其他成分抑制As的溶出而降低其毒性[12]，我们的实验证明六神丸中雄黄的As溶解度是增加的，表明六神丸组分的相互作用可增加As的溶出。

表2 六神丸及相关砷化物的As溶解度差异

药物溶解度(%)LSW174As4S416As2S230As3+885As5+1047ATO541

2.3 六神丸诱导细胞凋亡作用 六神丸各浓度组均有诱导肿瘤细胞凋亡的作用，且随着浓度增加而增强，0.1和0.3 mg/mL浓度与对照之间差异具有统计学意义(P<0.05，见表3)。

组别六神丸浓度(mg/mL)凋亡细胞(%)死亡细胞(%)正常对照组0571±1315±13低浓度六神丸00386±4412±02中浓度六神丸01100±10∗23±04高浓度六神丸03154±34∗25±02

*表示与正常对照组比较，P<0.05。

2.4 六神丸对细胞周期的影响 六神丸对Hep3B细胞的细胞周期有轻微的阻滞作用，但与对照组比的差异无统计学意义(P>0.05，见表4)。

组别六神丸浓度(mg/mL)G0～G1SG2～M正常对照组0479±33361±74159±41低浓度六神丸003496±27311±65193±46中浓度六神丸01485±30289±74226±44高浓度六神丸03504±38314±88154±47

2.5 六神丸对凋亡相关基因表达的影响 六神丸1.0和10 mg/mL浓度明显降低抑制凋亡基因Bcl-2和Bcl-wmRNA的表达(P<0.05，见表5)，此结果与流式细胞术的结果相互印证。

组别六神丸浓度(mg/mL)抑制凋亡基因Bcl-2Bcl-w正常对照组0100±61100±700 低浓度六神丸01100±12050±300中浓度六神丸10 76±22∗30±82∗高浓度六神丸100 56±31∗29±95∗

*表示与正常对照组比较，P<0.05。

2.6 六神丸对其他相关基因表达的影响 六神丸明显降低与耐药相关ABC转运载体超家族G亚家族第2号(ABCG2)及血管内皮生长因子(VEGF)mRNA的表达，同时抑制与肿瘤转移相关的基质金属蛋白酶-9基因(MMP-9)的表达(P<0.05，见表6)，提示六神丸抗肝癌的作用可能是多层次多角度的网络过程。

组别六神丸浓度(mg/mL)ABCG2VEGFMMP-9正常对照组0100±14．0100±29．0100±11．0低浓度六神丸01 41±14．0∗ 52±14．067±45中浓度六神丸10 39±15∗ 39±65∗ 41±22∗高浓度六神丸100 55±37∗ 30±11．0∗ 35±35∗

*表示与正常对照组比较，P<0.05。

3 讨论

中国是肝病大国，在我国，被称为“癌中之王”的肝癌发病率较高，且不易被早期诊断，恶性度高，易转移，治疗难度大。近年来，在肝癌治疗及药物的作用机制方面进行了大量研究，并取得一定成绩。六神丸是我国四大名药之一，临床上用其治疗多种疾病[2]，其在体内外均有较好的抗肿瘤作用[2-11]，但其对肝癌的治疗鲜有报道，本实验结果表明，六神丸通过不同的途径发挥抗肝癌细胞的作用。

实验表明，六神丸和砷化合物均有杀灭Hep3B肝癌细胞的活性，但六神丸抑制Hep3B肝癌细胞增殖的IC50值明显小于雄黄、As2O3、As2S2和As5+。我们以前的实验显示六神丸或雄黄不同于环境中含砷化合物，其安全系数较大，为进一步开发其抗肿瘤作用提供了实验依据[13-19]，也未发现六神丸复方减少雄黄中砷的释放和在组织中的蓄积[13]。这次实验结果表明六神丸中砷的溶出明显高于雄黄中砷的溶出量，提示组方中其他药物可能促进砷的溶出。

诱导凋亡是抗肿瘤药物的一个重要机制，报道表明六神丸诱导的白血病细胞凋亡与其上调Bax、下调Bcl-2基因的表达有关[20]，其含药血清诱导人乳腺癌MCF-7细胞的凋亡，系上调Caspase-3的表达[21]。我们的实验发现，六神丸诱导凋亡的同时可明显下调抑制凋亡基因Bcl-2、Bcl-wmRNA的表达。

克服肿瘤细胞的耐药性是抗肿瘤治疗研究的一个难题。报道指出六神丸可通过影响P170和TopoⅡβ的表达而杀灭耐药的白血病细胞[22]，细胞外排蛋白ABCG2把化疗药物排出细胞外而产生耐药性，且这种耐药性在多种化疗药物之间交叉存在[23]。本实验结果显示，六神丸可以明显降低ABCG2的表达，说明六神丸应用于治疗肿瘤时，其可能通过降低与药物外排相关蛋白的表达而产生较理想的远期疗效。

肿瘤的发生发展需要新生血管的形成为其提供充足的营养成分，在血管生成的众多生长因子调节中，VEGF是目前已知作用最强、专属性最高的促血管生长因子。有报道表明，六神丸明显降低S180肉瘤模型小鼠VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(β-FGF)的表达而降低微血管密度，协同阻止肿瘤组织血管生成[24-25]。本实验结果显示，小剂量六神丸即可明显降低VEGF的表达，提示六神丸也可以通过阻止新生血管的生成而抑制肿瘤生长。

癌肿的局部扩散和转移是肝细胞癌致死的主要原因之一。基质金属蛋白酶9(MMP-9)可降解基质，使肿瘤细胞容易侵袭转移。六神丸含药血清能下调β-FGF和MMP-9的表达，从而减少人乳腺癌MCF-7细胞的侵袭转移[19]。在本实验中，六神丸可以明显下调MMP-9基因表达，提示六神丸可抑制肿瘤转移，机制与其抑制MMP-9蛋白酶对基质的降解，降低血管通透性有关。

中药复方抗肿瘤作用是通过多种途径、多个靶点实现的，六神丸中的雄黄为君药，蟾酥为臣药，其他成分为佐药和使药，各成分之间相互协同而发挥更好的抗肿瘤作用，这正是中药复方的作用特点。

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[收稿2016-10-02;修回2016-11-01]

(编辑：王静)

Effects of Liu-Shen-Wan and arsenic compounds on hepatoma Hep3B cells

LiangShixia1,4,LiuZhengyun1,YuLimei2,LiuYun3,GuoJing4,JiaZhicheng4,TuoJunxiong4,LiuJie1

(1.Key Lab for Basic Pharmacology of Ministry of Education,Department of Pharmacology,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 2.Key Lab of Cell Engineering,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 3.Guizhou Provincial College-Based Key Lab for Tumor Prevention and Treatment with Distinctive Medicines,Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099,China; 4.Department of General Studies,School of Public Health of Yulin City,Yulin Shanxi 719000,China)

Objective Arsenic (As) is effective for blood malignancies but little is known about its effects on solid tumors.This study aimed to examine the effect of As-containing Liu-Shen-Wan (LSW) and As compounds [Na2HAsO4(As5+),NaAsO2(As3+),As2O3,As4S4and As2S2] on the proliferation of the human hepatoma Hep3B cells and the potential mechanisms.Methods Cultured Hep3B cells were treated with LSW and arsenic compounds for 6-48 h.The cytotoxicity,cellular arsenic accumulation,cell cycle regulation,and the expression of genes related to apoptosis were examined.Results The release of As from LSW was higher than As4S4and As2S2,but was much lower than NaAsO2,Na2HAsO4,and As2O3.LSW was effective in inhibition of Hep3B cell proliferation,an effect secondary to NaAsO2,but stronger than As4S4.LSW induced apoptosis of the cells,but had no major effects on cell cycles.LSW down-regulated the expression of Bcl-2 and Bcl-w,and inhibited the gene expression of breast cancer resistance protein (BCRP/ABGC2),vascular endothelial growth factor (VEGF) and matrix metallopeptidase 9 (MMP-9).Conclusion Arsenic release depends on chemical forms of arsenicals.LSW showed antitumor effects towards hepatoma Hep3B cells,probably though apoptosis and tumor growth-related gene expressions.

Liu-Shen-Wan; antitumor; Hep3B cells; arsenic compounds; apoptosis

贵州省科技厅基金资助项目(NO:TZJF 2010-5和2013-03)；贵州省教育厅特色重点实验室建设项目(NO:黔教合KY字[2014]212)。

刘杰，男，教授，研究方向：药理毒理学，E-mail:jieliu@zmc.edu.cn。

R966

A

1000-2715(2016)06-0558-05