黄　东，李跃林，卜　凯，黄　文，莫伟彬，2

(1.广西师范大学体育学院，广西桂林541006；2.药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室，广西桂林541004)



黄酮对运动大鼠脂肪代谢酶与ERRα表达的影响

黄东1，李跃林1，卜凯1，黄文1，莫伟彬1，2

(1.广西师范大学体育学院，广西桂林541006；2.药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室，广西桂林541004)

摘要：为探讨耐力训练对大鼠脂肪代谢酶、雌激素受体关联受体α(ERRα) mRNA及蛋白表达与补充甘草黄酮的干预作用，选用SD雄性大鼠50只，每组10只，随机分为安静对照组(NC)、运动对照组(NE)、运动+补充甘草黄酮低(GFML，4 g·kg-1·d-1)、中(GFME，8 g·kg-1·d-1)、高(GFMH，12 g·kg-1·d-1)剂量组。对照组灌胃等量生理盐水，6周的力竭训练后，宰杀大鼠。根据试剂盒的方法测定大鼠血清肝脂酶(HL)、脂蛋白酯酶(LPL)、载脂蛋白CⅡ(ApoCⅡ)和载脂蛋白CⅢ(ApoCⅢ)含量和骨骼肌ERRα mRNA及蛋白表达水平，结果发现：运动对照组HL含量低于安静对照组(P<0.05)，GFM各组HL含量高于运动对照组(P<0.05或P<0.01)。LPL含量在NE组高于NC组(P<0.05)，GFM各组LPL含量高于安静对照组和运动组。ApoCⅡ含量在运动对照组高于安静对照组(P<0.05)，GFM各组ApoCⅡ含量与安静对照组比较有显著性差异(P<0.05或P<0.01)。运动对照组ApoCⅢ含量低于安静对照组(P<0.05)，GFME组和GFMH组ApoCⅢ含量与安静对照组比较有显著性差异(P<0.05)。NE组大鼠脂肪组织ERRα mRNA及蛋白表达水平高于NC组(P<0.05)，在GFML、GFME和GFMH各组大鼠脂肪组织ERRα mRNA及蛋白表达都高于NC和NE组(P<0.05或P<0.01)。综上可见，补充甘草黄酮能够改善血脂代谢和调控酶水平在机体内的相对稳定性，从而防止脂代谢紊乱。

关键词：甘草黄酮；力竭运动；脂肪代谢酶；雌激素受体关联受体α

甘草(Licorice)是一种中草药，具有味甘、性平和解毒等作用。随着研究的不断深入，人们发现甘草的药效成份主要存在于黄酮类化合物和甘草甜素类化合物上[1-2]，其中甘草黄酮(glycyrrhiza flavonoids， GF)属于黄酮类化合物的一种，对机体具有抗自由基能力、保护机体各器官系统(肝脏、心肌、胃组织等)、抗肿瘤、抗炎和降血糖等作用[3]。笔者前期研究发现[4-5]，甘草黄酮对力竭性运动大鼠具有抗自由基能力、减轻脂质过氧化的反应、提高大鼠体内糖的储备、维持血糖浓度稳定、保护肝细胞和下调脂肪组织视黄醇结合蛋白4(RBP4)等作用。本研究通过运动前补充不同剂量的甘草黄酮对力竭性运动大鼠脂肪代谢酶及雌激素受体关联受体α(estrogen-related receptor α，ERRα) mRNA及蛋白表达，来观察其对机体能量代谢的作用，为进一步深入研究甘草黄酮提供实验支持和理论依据。

1材料

1.1动物

SD雄性健康大鼠50只，大鼠的平均体质量(200.2±10.2) g，由广西医科大学(广西实验动物中心)动物房提供(SPF级，生产许可证SCXK桂2014-0002)。动物室温度(23±5) ℃，相对湿度45%～70%，以基础饲料饲养，自由饮水和摄食。

1.2药物与试剂

实验药物材料为甘草黄酮提取物，主要由西安通泽生物科技有限公司提供，纯度达到95.8%；测定血清用的肝脂酶试剂盒(HL)、脂蛋白酯酶试剂盒(LPL)均为南京建成生物工程研究所产品；载脂蛋白CⅡ试剂盒(ApoCⅡ)、载脂蛋白CⅢ试剂盒(ApoCⅢ)均为上海源叶生物科技有限公司产品；测定脂肪组织ERRα mRNA表达试剂盒(美国ABI公司生产)；Trizol试剂盒、100 bp DNA Marker和6RNA Loading Buffer均为上海生工生物工程股份有限公司产品；β-actin和ERRα抗体为鼠单抗(一抗体)、羊抗鼠IgG-Biotin(二抗体)、BCA Protein Assay Kit蛋白定量试剂盒、PVDF膜和考马斯亮蓝均为武汉博士德生物工程有限公司产品。

1.3仪器

ZH-PT型动物跑台(正华，淮北正华生物仪器设备有限公司)，6331型PCR仪(德国Eppendorf公司)，DYY-6C型电泳仪(北京六一仪器厂)，K241R型离心机(英国森特恩 Centurion公司)，Keta M型化学发光系统(美国威泰克Wealtec公司)，凝胶成像分析系统(Dolphin-Doc，美国威泰克Wealtec公司)，恒温摇床(HT-3112A，上海赫田科学仪器有限公司)，紫外可见分光光度计(UV-1800A，北京美析仪器)。

2方法

2.1分组与给药量

将大鼠随机分为5组：安静对照组(NC)，运动对照组(NE)，运动+灌胃甘草黄酮低剂量组(GFML)、中剂量组(GFME)和高剂量组(GFMH)，剂量分别为4、 8、12 g·kg-1·d-1(相当于成人推荐剂量的5、10、30倍)，灌胃体积为5 mL·kg-1，对照组灌胃用等量生理盐水，各组大鼠均在运动前半小时给药，给药6周，1次/d，直到实验结束。

2.2动物模型与取材

大鼠进行适应性运动1周后(跑台坡度为0(°)，速度为15 m/min，训练时间为30 min/d)，接着进行为期6周的力竭运动训练。训练模型按Bedford[6]和参考文献[7]进行设计并略加调整：大鼠运动速度为19.3 m/min(相当于76%的VO2max)， 跑台坡度为5(°)，每天训练1次，每次训练的时间不少于60 min，6 d/周，对于短时间内力竭的大鼠，休息5 min 后再进行力竭训练，使训练时间在60 min以上。力竭标准：大鼠在跑台上不能正常运动，四肢无力、呼吸加深、腹卧位并且受到刺激和驱赶后无反应。训练结束后，取材大鼠禁食12 h以上，于次日8时经200 g/L乌拉坦溶液(3 mL/kg)麻醉，取血液5 mL于试管中，并经4 000 r/min转速离心15 min，分离血清后于冰箱中保存；迅速取出大鼠脂肪组织(股四头肌)并称量，用预冷生理盐水清洗，滤纸吸干，包裹后放入-80 ℃冰箱中待测。各个指标的测定方法严格按试剂盒提供的

表1　引物序列与扩增长度

步骤进行。

2.3脂肪组织(股四头肌)ERRα mRNA表达检测

2.3.1大鼠ERRα与β-actin基因引物

基因引物由上海生工设计合成，见表1。

2.3.2ERRα mRNA表达水平

根据前期研究[8]方法检测ERRα mRNA表达。首先，取150 mg股四头肌组织进行匀浆，采用Trizol原理提取脂肪组织RNA含量，经紫外可见分光光度计(波长在260 mm和280 mm)的吸光度检测RNA纯度和浓度，其比值均在1.8～2.0，说明RNA的纯度较好。然后取10 μL RNA根据RT-PCR试剂盒说明书转录为cDNA(RT反应)，反应体系为：常温反应15 min，42 ℃、50 min，95 ℃、5 min，4 ℃、10 min；取5 μL cDNA作为PCR反应模板进行ERRα 扩增反应，PCR反应体系为：95 ℃、5 min，95 ℃、30 s，58 ℃退火30 s，72℃延伸30 s，28次循环，最后72 ℃延伸5 min停止反应；取10 μL PCR扩增产物在15 g/L的琼脂糖凝胶板进行电泳(105 V、65 min)，电泳结果经Dolphin-Doc凝胶成像系统分析灰度值，其比值采用ERRα/β-actin表示。

2.4Western Blot 法检测脂肪组织ERRα 蛋白

取150 mg股四头肌组织，经剪碎后液氮研磨，加组织裂解液充分裂解后倾入离心管中，冷冻离心机离心(4 ℃、15 000 r/min、15 min)；取上清液转入EP管中，BCA法进行蛋白浓度定量。采用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝胶)电泳[8]，转膜(电流14 V、 100 mA、转印2 h)、封闭过夜后转入PVDF膜上。加β-actin和ERRα抗体(1∶500) 4 ℃孵育过夜。加羊抗鼠IgG-Biotin(1∶1 000)孵育50 min，经PBST 洗膜后，加ECL化学发光底物于膜上，5 min后置于转移膜上进行曝光、显影、定影，采用凝胶成像系统对ERRα与β-actin蛋白条带进行灰度扫描并用比值表示。

2.5统计学处理

3结果

3.1力竭运动训练大鼠HL、LPL、ApoCⅡ和ApoCⅢ含量的变化

力竭运动训练引起大鼠HL、LPL、ApoCⅡ和ApoCⅢ含量产生不同程度的变化，HL含量在NE组低于NC组(P<0.05)，GFM各组HL含量高于NE组(P<0.05或P<0.01)。LPL含量在NE组高于NC组(P<0.05)，GFM各组LPL含量高于NC组和NE组，其中GFML和 GFME组LPL含量与NC组比较有显著性差异(P<0.05)，GFMH组LPL含量与NC组和NE组比较有极其显著性差异(P<0.01)。ApoCⅡ含量在NE组高于NC组(P<0.05)，GFM各组ApoCⅡ含量高于NC组，其中GFML组ApoCⅡ含量与NC组比较有显著性差异(P<0.05)，GFME组和 GFMH组ApoCⅡ含量与NC组比较有极其显著性差异(P<0.01)。ApoCⅢ含量在NE组低于NC组(P<0.05)，GFM各组ApoCⅢ含量高于NE组但低于NC组，其中GFME组和 GFMH组ApoCⅢ含量与NE组比较有显著性差异(P<0.05)，见表2。

表2　各组大鼠血清HL、LPL、ApoCⅡ和ApoCⅢ含量的比较

注：与安静对照组比较①表示P<0.05，②表示P<0.01；与运动对照组比较③表示P<0.05，④表示P<0.01。

3.2力竭运动训练大鼠脂肪组织ERRα mRNA表达的变化

力竭运动训练引起大鼠脂肪组织ERRα mRNA表达水平发生不同程度的变化，NE组大鼠脂肪组织ERRα mRNA表达水平高于NC组(P<0.05)，在GFML、GFME和GFMH各组大鼠脂肪组织ERRα mRNA表达水平都高于NC和NE组，但与NC组比较具有极其显著性差异(P<0.01)，与NE组比较无显著性差异(P>0.05)，详见图1、表3。

NC：安静对照组；NE：运动对照组；GFML：运动+低剂量甘草黄酮4 g·kg-1组；GFME：运动+中剂量甘草黄酮8 g·kg-1组；GFMH：运动+高剂量甘草黄酮12 g·kg-1组。图1　各组大鼠脂肪ERRα mRNA产物电泳图Fig.1　Electrophoresis of ERRα mRNA product in adipose tissue of rats in each group

组别剂量/(g·kg-1)ERRαmRNA/β-actinERRα蛋白/β-actin安静对照-0.93±0.160.91±0.17运动对照-1.72±0.11①1.43±0.12①运动+甘草黄酮(低)41.74±0.18②1.44±0.15①运动+甘草黄酮(中)81.89±0.13②1.86±0.11②③运动+甘草黄酮(高)121.93±0.10②1.87±0.19②③

注：与安静对照组比较①表示P<0.05，②表示P<0.01；与运动对照组比较③表示P<0.05，④表示P<0.01。

3.3力竭运动训练大鼠脂肪组织ERRα蛋白表达的变化

力竭运动训练引起大鼠脂肪组织ERRα蛋白发生不同程度的变化，NE组ERRα蛋白表达高于NC组(P<0.05)；在GFML、GFME和GFMH各组大鼠脂肪组织ERRα蛋白表达都高于NC和NE组，其中GFML组与NC组比较有显著性差异(P<0.05)；GFME和GFMH组与NC组比较具有极其显著性差异(P<0.01)，与NE组比较有显著性差异(P>0.05)；见图2、表3。

NC：安静对照组；NE：运动对照组；GFML：运动+低剂量甘草黄酮4 g·kg-1组；GFME：运动+中剂量甘草黄酮8 g·kg-1组；GFMH：运动+高剂量甘草黄酮12 g·kg-1组。图2　各组大鼠脂肪ERRα蛋白表达Fig.2　The expression of ERRα protein in rats of each group

4讨论

4.1运动训练对大鼠HL、LPL、ApoCⅡ和ApoCⅢ含量的影响

肝脂酶(hepatic lipase， HL)和脂蛋白酯酶 (lipoprotein lipase， LPL)是机体内的脂酶，同属于脂酶家族。HL具有水解甘油三酯、磷酯和清除乳糜微粒等功能。LPL存在于脂肪、心肌和骨骼肌等细胞中，能够水解血浆乳糜微粒和极低密度脂蛋白中的甘油三酯和参与转换磷脂的作用[9]。载脂蛋白CⅡ(ApoCⅡ)和载脂蛋白CⅢ(ApoCⅢ)具有调节脂蛋白代谢酶的生物学功能[10]。Totsuka等[11]研究发现，ApoCⅡ在脂肪代谢中是LPL重要的激活剂，而ApoCⅢ则是抑制LPL对甘油三酯的酯解和肝脏中HL的活性，从而减弱了肝脏对富甘油三酯的摄取。因此，HL、LPL、ApoCⅡ和ApoCⅢ在运动中一旦发生变异将会引起其生理功能的异常。路瑛丽等[12]研究发现，大鼠通过低氧训练后HL含量降低，LPL含量提高，提示低氧训练能够改善血脂代谢。亢建国等[13]研究发现，大鼠运动训练后补充灵芝多糖HL含量降低，LPL含量提高。本研究发现，运动对照组大鼠HL含量低于安静对照组，LPL含量在运动对照组高于安静对照组，而补充不同剂量的甘草黄酮后，HL含量与运动对照组比较有所提高，而LPL含量高于安静对照组和运动对照组，这与郭英杰等[14]研究相一致，提示力竭运动训练和补充甘草黄酮能够改善血脂代谢和调控酶水平，从而防止脂代谢紊乱。本研究还发现，力竭训练后大鼠ApoCⅡ含量高于安静对照组，ApoCⅢ含量明显低于安静对照组；而通过补充不同剂量的甘草黄酮后，ApoCⅡ的含量明显高于安静对照组，在中剂量组和高剂量组同样高于运动对照组，而ApoCⅢ含量则高于运动对照组但低于安静组。本研究结果提示：力竭运动后能够使大鼠血清ApoCⅡ含量与LPL活性的提高和ApoCⅢ含量的降低；而通过补充不同剂量的甘草黄酮则有利于改善脂肪代谢的紊乱，防止高脂血症，但其机制还有待深入研究。

4.2运动训练对大鼠ERRα mRNA及蛋白表达的影响

ERRα是最早被发现的孤儿核受体，属ERR家族成员(ERRα、ERRβ和ERRγ)之一，主要分布于骨骼肌、心肌、肝和肾等组织中，对调节机体内的能量代谢和能量转换的信号应答具有重要的作用[15]。Cartoni等[16]研究发现，长距离的自行车运动后，致使运动员ERRα mRNA水平显著升高。石越丹等[17]和姬卫秀等[18]研究发现，不同的时间耐力训练引起小鼠骨骼肌ERRα mRNA及蛋白的表达水平显著升高。本研究发现，力竭训练引起大鼠脂肪组织ERRα mRNA及蛋白表达水平高于安静对照组。这与Maret等[19]研究结果相一致，提示耐力训练可能提高了ERRα mRNA及蛋白表达在机体内的相对稳定性。通过补充不同剂量的甘草黄酮后ERRα mRNA及蛋白的表达水平都高于安静对照组和运动对照组，并且在高剂量组时ERRα mRNA及蛋白的表达水平达到峰值。这可能与甘草黄酮调节机体内能量代谢的转换和脂肪氧化供能的作用有关，提示甘草黄酮具有调节机体内酶的代谢，防止脂代谢紊乱的作用，但其机制还有待深入研究。

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(责任编辑马殷华)

Effects of Glycyrrhiza Flavonoids on Lipid Metabolism Enzyme and Expression of ERRα mRNA and Protein of Exhaustive Rats

HUANG Dong1， LI Yuelin1， BU Kai1， HUANG Wen1， MO Weibin1，2

(1. Sport School of Guangxi Normal University， Guilin Guangxi 541006， China；2. State Key Laboratory Cultivation Base for the Chemistry and Molecular Engineering of Medicinal Resources，Ministry of Science and Technology of China， Guilin Guangxi 541004， China)

Abstract:In order to explore the intervention effect of endurance training of fat Rats on the lipid metabolism enzyme, Expression of ERRa mRNA and Protein and the complementary licorice flavonoids. Fifty healty male Sprague-Dawley rats were Randomly chosen for groups, each consisting of 10 rats: the quiet control group(NC), the exercise group(NE), the administration of licoflavone in low dose exercising group (GFML, 4 g·kg-1·d-1), the administration of licoflavone in middle dose exercising group (GFME, 8 g·kg-1·d-1) and the administration of licoflavone in high dose exercising group (GFMH,12 g·kg-1·d-1). After the rats in control group were administrated of pure physiological saline at the same dose, the rats were killed after 6-week training. According to the kit method of determination of on lipid metabolism enzyme (HL, LPL, ApoCⅡand ApoCⅢ)in serum of rats and Expression of ERRa mRNA and Protein and The HL content in the quiet control group is lower than that of the exercise group ((P<0.05), The content of HL in GFM was higher than that of in the exercise group((P<0.05). The content of LPL was higher than that of the quiet control group (P<0.05), The content of LPL in GFM was higher than that of the quiet control group and the exercise group. The content of ApoCⅡin the exercise group was higher than that of the quiet control(P<0.05), The content of ApoCⅡin GFM, compared with the quiet control group is significantly different (P<0.05 or P<0.01), The content of ApoCⅢ is lower than that of the quiet control group(P<0.05), which means there are significantly different between GFME and GFMH and the quiet control group (P<0.05).The Adipose tissue Expression of ERR mRNA and Protein in NE was higher than that of the NC (P<0.05). The Adipose tissue Expression of ERR mRNA and Protein was higher than that of the NC and NE (P<0.05 or P<0.01). Supplement of glycyrrhiza flavonoids can improve blood lipid metabolism and regulate enzyme levels in the body of relative stability so as to prevent lipid metabolic disorder.

Keywords:licoflavone； exhaustive exercise； ipid metabolism enzyme； ERRα

中图分类号：R285.5

文献标志码：A

文章编号：1001-6600(2016)01-0168-06

基金项目：国家自然科学基金资助项目(31460232，21562006)；广西高校科研项目(YB2014384)；“药用资源化学与药物分子工程教育部重点实验室”开放课题 (CMEMR2012-B04)；广西研究生创新项目(YCSW2015084)

收稿日期：2015-10-08

doi:10.16088/j.issn.1001-6600.2016.01.027

通信联系人：莫伟彬(1979—)，男，广西桂平人，广西师范大学教师。E-mail： mogaol@163.com