吴丽丽 周延宾 蔡思琪 赵建国

摘 要 为建立鸡早期性别鉴定的快速方法，根据鸡CHD基因在性染色体Z和W上的序列长度差异，从鸡血样中提取基因组DNA，利用2550F/2718R和SF/SR引物分别对鸡CHD基因片段进行PCR扩增，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测。引物2550F/2718R 的PCR扩增结果显示，公鸡为1条带，约600 bp，母鸡为2条带，分别约为600 bp和450 bp；引物SF/SR PCR扩增结果显示，公鸡为1条带，约500 bp，母鸡为2条带，分别约为500 bp和350 bp；两对引物扩增的条带清晰明亮，特异性强，鉴定的性别与实际性别完全相符。说明本实验建立的PCR方法准确可靠，可用于鸡早期性别鉴定，在生产和科研上有广阔的应用前景。

关键词 CHD ；PCR ；鸡 ；性别鉴定

中图分类号 S836.2

鸡的性别与其价值关系密切，对鸡进行早期性别鉴定具有重要的经济意义。生产上常用翻肛鉴别法和伴性性状鉴别法。翻肛鉴别法必须在出壳后24 h（最好12 h）内进行，而且即使是经验丰富的翻肛员至少也有1.4 %的错误率，且会对雏鸡造成伤害[1]。而伴性性状鉴别法依赖于专门品种或品系之间的杂交，不能通用。随着分子生物学等学科研究的深入，鸟类的性别鉴定已经开发出了PCR方法，可以将鉴定的准确率提高至100 %，而且不受年龄限制，可以实现胚胎期的性别鉴定。染色体螺旋蛋白基因（chromobox-helicase-DNA binding gene，CHD）存在于鸟类性染色体Z和W上，Z染色体上的CHD表示为CHD-Z，W染色体上的CHD表示为CHD-W；因为雌鸟的性染色体组成是ZW型，雄鸟的性染色体组成为ZZ型，所以雌鸟中既含有CHD-Z又含有CHD-W，雄鸟中只有CHD-Z；CHD-Z和CHD-W外显子相似，内含子长度不同[2-4]。通过在CHD基因内含子两侧的保守区设计引物，对样本基因组进行PCR扩增，以CHD-Z和CHD-W为模板扩增出的片段长度不同，公鸡只能扩增出1个片段，而母鸡可以扩增出大小不同的2个片段，根据PCR产物的数量和片段大小可以推测个体的染色体组成，从而判断性别。

1 材料与方法

1.1 材料

刚出壳的海南儋州本地鸡，翼下静脉刺血，收集于已加入抗凝剂的离心管中，-20 ℃保存备用。然后解剖记录每只鸡的性别。选取其中的2只公鸡和2只母鸡的血样进行基因组DNA提取，PCR扩增及电泳检测。

试剂：血液基因组提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司，PCR试剂采用全式金super Mix，PCR引物交由上海生物工程技术有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物

选用2550F/2718R[5]和SF/SR[6]两对引物分别对4只鸡样本进行PCR性别鉴定。引物序列为：2550F：5′-GTTACTGATTCGTCTACGAGA-3′，2718R：5′-ATTGAAATGATCCAGTGCTTG-3′；SF：5′-AGTGCATTGCAGAAGCAATATT-3′，SR：5′-GCCTCCTGTTTATTATAGAATTCAT-3′。

1.2.2 PCR体系和程序

25 μL体系：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，PCR Mix 12.5 μL，ddH2O 9.5 μL。反应程序：94.0 ℃ 5 min；94.0 ℃ 30 s，54.0 ℃ 30 s，72.0 ℃ 40 s，35个循环；72.0 ℃ 7 min，4 ℃保存。

1.2.3 电泳检测

吸取10 μL PCR扩增产物用1.5 %的琼脂糖凝胶电泳检测，在紫外检测仪下观察结果，并拍照记录。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA

将提取的鸡基因组DNA用1.0 %的琼脂糖凝胶进行电泳检测。由图1可知，鸡基因组DNA电泳图呈现致密亮带，表明所提DNA质量良好，可用于PCR扩增。

2.2 PCR扩增结果

利用2550F/2718R和SF/SR两对引物分别对鸡基因组DNA进行PCR扩增结果见图2。引物对2550F/2718R PCR扩增产物为：公鸡有1条带，片段长约600 bp，母鸡有2条带，1条片段长度约600 bp，和公鸡相当，另一条片段长450 bp。引物对SF/SR PCR扩增产物为：公鸡有1条约500 bp的条带，母鸡有2条带，1条长度同公鸡相当，约500 bp，另一条约350 bp。PCR性别鉴定结果与已知性别完全吻合，条带清晰明亮，无杂带，证明两对引物都可以特异高效的扩增鸡Z和W染色体的CHD基因片段，PCR体系配比和PCR所设条件适宜，所采用的方法可以准确鉴定鸡的性别。

3 讨论与结论

3.1 利用CHD基因性别鉴定

CHD基因存在许多鸟类中，其进化速率慢，序列非常保守，已成为非平胸类鸟类性别鉴定的分子标记[7]。Griffiths等[2，8]利用CHD基因设计引物P2/P3和P2/P8对约30种鸟类性别进行了准确鉴定；盖玉林等[9]利用CHD基因和引物P2/P8准确鉴定了画眉和红嘴相思鸟的性别；陈蓉等[10]利用CHD基因和引物2550F/2718R对美洲红鹮和火烈鸟的性别进行了准确鉴定；张莉等[11]和吕夕超等[12]分别利用该基因对鸽子和信鸽进行了性别鉴定。

3.2 性别的判定

利用CHD基因进行性别鉴定，以CHD-Z为模板扩增出的条带称为Z带，以CHD-W为模板扩增出的条带为W带。理论上扩增出1条带说明基因组只含有Z染色体，为公鸡，扩增出2条带说明基因组含有Z和W染色体，为母鸡，根据条带的数目即可判断性别。笔者和刘宏祥等[6]研究结果均发现：母鸡样本中Z带和W带的合成存在竞争关系，W带因为较短合成效率较高，更容易扩增出来，在模板质量不好或者反应条件不适宜时，可能出现母鸡基因组扩增不出Z带的情况，所以母鸡样本有时也会出现1条带的情况。在实际操作时，除了通过条带数目还应该观察条带大小进行性别判定，如果PCR产物只有W带，也可判定为母鸡。

3.3 PCR法性别鉴定展望

鸡作为主要经济动物在畜牧生产中一直占有重要地位，为获得不同的产品要对家鸡性别做严格的选择，对鸡胚或雏鸡进行性别鉴定并分流可大大节省人力、物力，降低生产成本。除鸡以外，家鸽、信鸽、大部分鸟类均可以利用该基因进行性别鉴定。PCR方法因为直接检测动物的分子本质，故性别判断的准确率高，且对动物的伤害小，不受发育时期的限制，优势明显。特别对于存在性反转，或者性别分化不明显的个体，作为判定的标准更为适宜。随着实验技术的不断改进，PCR鉴定方法越来越简单、经济、快捷，必将在生产实践中发挥更大的作用。

鸡的性别可以利用CHD基因及引物对2550F/2718R或SR/SF进行准确鉴定。引物对2550F/2718R判断标准为：PCR产物有1条约600 bp条带者为公鸡，有600 bp和450 bp两条带者为母鸡，如果只出现450 bp条带，也可以判定为母鸡。引物对SF/SR判断标准为：PCR产物有1条约500 bp的条带者为公鸡，有约500 bp和350 bp两条带者为母鸡，如果只出现1条约350 bp条带也可以判定为母鸡。两对引物扩增效率高且特异，所设条件适宜，本试验方法可以准确的鉴定鸡早期性别，在生产和科研上有广阔的应用前景。

参考文献

[1] 王晓峰. 鸡胚性别鉴别——家禽科学研究的新视点[J].中国家禽，2003，25（14）：23-33.

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[5] Anna K F， Hans E. A simple and universal method for molecular sexing of non-ratite birds[J]. Avian Biology， 1999， 30：116-121.

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[7] Ellegren H. First gene on the avian W chromosome （CHD） provides a tag for universal sexing of non-ratite birds[J]. Proc Royal Soc London B， 1996， 263（1377）：1 635-1 641.

[8] Griffiths R， Double M C， Orr K， et al. A DNA test to sex most birds[J]. Mol Ecol，1998，7（8）：1 071-1 075.

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[10] 陈 蓉，陈 楠，章小小，等. 美洲红鹮和火烈鸟性别的分子鉴定[J]. 畜牧与兽医，2014，46（1）：60-62.

[11] 张 莉，单达聪，刘 彦，等. 通过CHD基因快速鉴定鸽子性别方法的研究[J]. 中国畜牧兽医，2016，43（5）：1 379-1 384.

[12] 吕夕超，叶 超，纪丝保，等. 通过CHD基因鉴定信鸽性别[J]. 中国畜牧杂志，2015，51（9）：12-15.