吴老五,韩秀荣,吴 婷,杜 锦,石晓勇,*(1.中国海洋大学化学化工学院,山东 青岛 266100；2.中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室,山东 青岛 266100；.国家海洋局海洋减灾中心,北京100194)



重金属对浒苔吸收硝酸盐的动力学特性影响

吴老五1,2,韩秀荣1,2,吴 婷3,杜 锦1,2,石晓勇1,2,3*(1.中国海洋大学化学化工学院,山东 青岛 266100；2.中国海洋大学海洋化学理论与工程技术教育部重点实验室,山东 青岛 266100；3.国家海洋局海洋减灾中心,北京100194)

摘要：为探讨大型海藻对重金属胁迫的响应,选取浒苔(Ulva prolifera)为实验材料,通过实验室一次性培养实验,从大型藻营养盐吸收动力学角度,研究了Cu(II)、Zn(II)和Pb(II)对浒苔吸收硝酸盐动力学参数的影响.结果表明:较低浓度的Cu(II)(<0.04mg/L)和Zn(II)(<0.12mg/L)对浒苔吸收硝酸盐具有促进作用;当达到一定浓度(Cu(II)>0.10mg/L和Zn(II)>0.20mg/L)时则对浒苔吸收硝酸盐表现为明显的抑制作用,Pb(II)对浒苔吸收硝酸盐均是抑制作用.Cu(II)、Zn(II)和Pb(II)对浒苔吸收硝酸盐的最大吸收速率(Vmax)抑制率IPC50分别为0.23,0.66,0.63mg/L.当添加重金属浓度大于0.50mg/L时,重金属对浒苔吸收硝酸盐的抑制顺序为:Cu(II)最强,Pb(II)次之,Zn(II)最小.

关键词：浒苔；硝酸盐；重金属

* 责任作者, 教授, shixy@ouc.edu.cn

2007～2015年,南黄海近岸海域连续9年暴发以浒苔为肇事藻种的绿潮灾害[1-2].在上游河流和人为活动的共同作用下,重金属污染物质和大量的营养盐物质一道被输送至河口海岸地区,使得重金属成为与绿潮现象相伴随的重要污染物[3-5].研究表明,一些重金属如:Hg、Cu、Cd、Pb,通过影响大型海藻的光合色素含量和超氧化物歧化酶等生理生化指标[6-7],进而促进或抑制藻体的生长.因此,它们有可能对绿潮的形成起着重要的作用.氮营养盐对黄海浒苔绿潮暴发起到重要的物质支撑作用[2].尤其是硝酸盐(NO3--N),通常被认为是海洋中最主要的无机氮源,是正常海水中溶解无机氮含量最高的氮形态,对浒苔的生长起到重要的作用[8].已有研究表明,包括重金属在内的微量元素同水体中的营养盐以及某些特殊的有机物的存在形式和浓度直接影响着海洋微藻的生长、繁殖与代谢,进而影响赤潮形成和发展[9-10].目前,关于大型海藻对重金属吸附机理和富集动力学的研究已有很多[11-14],但有关重金属胁迫对植物的氮代谢影响机制的研究较少[15].因此,本研究通过研究重金属对浒苔吸收NO3--N的影响,再进一步探讨其对浒苔绿潮生消发展的作用.

本研究选择海洋中常见的Cu(II)、Zn(II)、Pb(II)3种重金属元素,通过室内培养实验(模拟沿岸海域条件下水体中不同的N浓度,以及不同浓度的重金属,并控制其他有关环境因子),分析了3种重金属在不同浓度水平下对浒苔NO3--N动力学吸收特性的影响作用,以期从近海海水重金属污染角度探讨其对浒苔吸收营养盐的影响,为进一步研究有害藻华治理及重金属污染海水的海藻修复提供数据资料和理论基础.

1　材料与方法

1.1 实验材料与预处理

浒苔藻体取自江苏省南通市如东紫菜养殖筏架区,经海水反复冲洗数次,去除表面的杂藻及其他附着物后,以f/2培养液(其中NaNO3、KH2PO4作为唯一外加氮源、磷源)为培养介质,保存于藻种室进行扩大培养.培养条件:温度为(15±1)℃,光照强度为 3000～4000lux,光照周期为L:D=12h:12h[16].每 隔3天更换一次培养液.

1.2 实验设计

挑选长势良好的健康浒苔饥饿培养48h后开始实验,此时培养液中原有的氮源已被浒苔吸收消耗.称取0.5g/L(鲜重)的浒苔,分别培养于1L已灭菌的玻璃锥形瓶中,营养液除NO3--N外,其他营养元素均按f/2配方添加,然后各培养瓶分别加入不同浓度的重金属和NO3--N.依据魏海峰等[15]的研究设定重金属的浓度范围,其中, Cu(II)、Zn(II)、Pb(II)的浓度梯度均设置为: 0.00,0.03,0.10,0.20,0.50,1.00mg/L,每个重金属浓度下NO3--N的浓度梯度均设置为:10.00,20.00, 40.00,80.00,160.00,320.00µmol/L, NO3--N的浓度设置参照吴婷[17]的研究结果即在此浓度范围内浒苔均能正常生长,每组设置2个平行,以不加重金属元素的空白组为对照.培养条件同1.1.实验开始1.5h后取一定量培养液经GF/F滤膜过滤,滤液采用QUAATRO(Bran + Luebbe GmbH)营养盐自动分析仪测定NO3--N浓度,测定的标准偏差为0.03µmol/L.

1.3 数据处理与分析

1.3.1 吸收动力学参数Vmax和Ks计算各培养体系中浒苔对NO3--N的吸收速率.并用米氏方程[18]描述浒苔对NO3--N的吸收动力学过程:

式中:V代表浒苔对NO3--N的吸收速率, µmol/ (g·h);Vmax代表最大吸收速率,µmol/(g·h);C代表培养液中NO3--N的浓度,µmol/L;Ks则代表半饱和常数,µmol/L.

另外,采用Sigmaplot12.5、SPSS11.5及Origin8.0对得到的实验数据分别进行统计学分析和非线性拟合,并对实验结果的显著性差异进行比较(P<0.05).

1.3.2 重金属对浒苔吸收NO3--N影响的定量评价 根据测定的动力学参数,定量评价重金属对Vmax的影响.同对照组相比,不同浓度的重金属对Vmax的抑制率IP可由下式求得:

式中:C=logCM,CM为重金属浓度;β0,β1为可调参数.定义重金属的影响抑制率IP为50%时,重金属浓度为IPC50,则上式可变形为:

式中:CM为重金属浓度,b为可调参数.这样由IP 对CM进行拟合即可直接得到IPC50.当低浓度重金属对NO3--N的吸收具有促进作用时,可用下式表示抑制率IPC50与重金属CM的关系:

式中:f、b为可调参数,f表示促进作用的大小.如果没有促进时,f=0,则式(4)与式(5)相同.

2　结果与讨论

2.1 Cu(II)对浒苔吸收NO3--N的影响

图1为各实验组浒苔在不同Cu(II)浓度下对NO3--N的吸收速率.实验条件下,除NO3--N浓度为10µmol/L的实验组外,其他组浒苔对NO3--N的吸收速率均在Cu(II)为0.03mg/L时出现峰值. 当Cu(II)浓度大于0.03mg/L时,浒苔对NO3--N吸收速率随Cu(II)浓度增加而下降的趋势较为明显,但当Cu(II)浓度大于0.20mg/L,其下降趋势相对比较平缓.

图1　不同Cu(II)浓度下浒苔对NO3--N吸收速率Fig.1　The uptake rates of nitrate by Ulva prolifera at different Cu(II) concentrations

进一步分析表明,不同Cu(II)浓度条件下,浒苔对NO3--N吸收速率与NO3--N浓度关系可用米氏方程(式1)描述,其拟合的相关系数R2> 0.99.因此可以得到不同Cu(II)浓度下,浒苔对NO3--N的吸收动力学参数Vmax和Ks(表1).结果表明,添加Cu(II)的各实验组浒苔吸收NO3--N的半饱和常数Ks均小于对照组,Ks值随着实验组添加Cu(II)浓度的升高而降低,表明加入Cu(II)后浒苔有容易吸收NO3--N的趋势.对于Vmax的变化来说,除添加Cu(II)浓度为0.03mg/L的实验组Vmax值大于对照组外,其他各组Vmax值均小于对照组,且随着添加Cu(II)浓度的增大而逐渐减小(P<0.05).

表1　不同Cu(II)浓度条件下浒苔对?N吸收动力学参数Table 1　The kinetic parameters related to nitrate uptake by Ulva prolifera under different concentrations of Cu(II)

为定量评价重金属的影响,根据测定的Vmax,以不添加Cu(II)的空白组为对照,计算不同浓度下重金属对浒苔吸收NO3--N的抑制率IP(式2).Cu(II)在低浓度下,其抑制率为负值,对浒苔吸收NO3--N具有促进作用.根据式(5)对浒苔吸收NO3-N最大吸收速率的抑制率与不同Cu(II)浓度之间进行方程拟合(图2).可以发现,当抑制率IP=0时,Cu(II)的浓度为0.04mg/L,即当Cu(II)的浓度低于0.04mg/L时,对浒苔吸收NO3--N起到促进作用.当抑制率IP=0.5时,计算的IPC50为0.23mg/L.

由图2可见,当Cu(II)<0.04mg/L时可以促进浒苔对NO3--N的吸收,这与铜是藻类生长必须的微量元素,参与藻类的新陈代谢和生理过程,对其生长有一定的促进作用有关[20];当Cu(II)的实验浓度为0.10mg/L 时, 添加Cu(II)对浒苔吸收NO3--N起到明显的抑制作用.其原因可能是铜能够通过Cu+和Cu2+之间的循环反应产生OH造成氧化胁迫,对维持藻类的正常生理活动的酶和光合作用器官造成氧化损伤,使藻类的正常生理活动受到破坏[21].同时铜也可以使藻细胞内钾和镁不可逆转的消失,对细胞膜的完整构成破坏[22].

图2　不同Cu(II)浓度对浒苔吸收NO3--N最大吸收速率的抑制率Fig.2　The effects of Cu(II) on the maximum absorption rate of nitrate uptake by Ulva prolifera

已有研究指出,在浮游藻类生长及吸收氮源的过程中,Cu(II)亦对其有着双重影响作用.一方面,在植物体内,Cu(II)可能以某些物质组分的形式存在,在藻类的某些生理过程中起到催化作用,比如作为酶的辅助因子促进藻类生长及光合作用;另一方面,Cu(II)作为一种重金属元素,当其在浮游植物体内大量积累时会影响浮游植物的代谢过程,且对浮游藻类的生长、繁殖产生毒性作用[23].其次,高浓度Cu(II)能够使藻类的生长和光合作用受到抑制,PS II电子速率降低、光合色素含量减少、抗氧化酶和硝酸还原(NR)活性受到影响等[24-25].朱喜锋[6]发现,龙须菜在Cu(II)作用下生长受到显著抑制的最低浓度为0.05mg/L,当Cu(II)浓度大于0.05mg/L时,龙须菜的相对生长速率、Fv/Fm、最大相对电子传递速率和相对电子传递速率显著下降.本研究的实验结果与之基本一致.

2.2 添加Zn(II)对浒苔吸收NO3--N的影响

图3为各实验组浒苔在不同Zn(II)浓度下对NO3--N的吸收速率.实验条件下,当添加Zn(II)浓度低于0.10mg/L时,其对浒苔吸收NO3--N具有促进作用.而当添加Zn(II)浓度为0.20～1.00mg/L 时,各实验组对NO3--N的吸收速率均小于对照组,其Vmax值亦小于对照组,说明较高浓度的Zn(II)(>0.20mg/L)对浒苔吸收NO3--N具有抑制作用,且抑制作用随着Zn(II)浓度的增大而增强.实验条件下,当NO3--N的浓度为10～20µmol/L,不同Zn(II)浓度对浒苔吸收NO3--N的影响较小,这与添加Cu(II)实验组情况相似.

图3　不同Zn(II)浓度下浒苔对NO3--N吸收速率Fig.3　The uptake rates of nitrate by Ulva prolifera at different Zn(II) concentrations

将图3中浒苔对NO3--N吸收速率与不同Zn(II)浓度的关系经过米氏方程拟合(R2> 0.99),得到不同Zn(II)浓度下,浒苔对NO3--N的吸收动力学参数Vmax和Ks(表2).可以看出,添加Zn(II)各实验组的Ks值均小于对照组,且随着添加Zn(II)浓度的升高,其Ks值逐渐降低,表明加入Zn(II)后浒苔有容易吸收NO3--N的趋势.此外, 在Zn(II)浓度为0.03mg/L和0.10mg/L的两实验组中,其Vmax值均大于对照组.

表2　不同Zn(II)浓度条件下浒苔对NO3--N吸收动力学参数Table 2　The kinetic parameters related to nitrate uptake by Ulva prolifera under different concentrations of Zn(II)

根据测定的最大吸收速率,以不添加Zn(II)的空白组为对照,计算不同浓度下重金属对浒苔吸收NO3--N的抑制率(式2).Zn(II)在0.03～0.10mg/L范围内,其抑制率IP均小于0.根据式(5)对浒苔吸收NO3--N最大吸收速率的抑制率与不同Zn(II)浓度之间进行方程拟合(图4).可以得到,当抑制率IP=0时,Zn(II)浓度为0.12mg/L.即当Zn(II)的浓度小于0.12mg/L时,随着Zn(II)浓度的增加,浒苔对NO3--N吸收的Vmax随之增加,添加Zn(II)对浒苔吸收NO3--N 起促进作用.当抑制率IP=0.5时,添加Zn(II)浓度为0.66mg/L.即在此浓度下,实验组的最大吸收速率为对照组的一半.

图4　不同Zn(II)浓度对浒苔吸收NO3--N最大吸收速率的抑制率Fig.4　The effects of Zn(II) on the maximum absorption rate of nitrate uptake by Ulva prolifera

综上所述,Zn(II)<0.12mg/L时可以促进浒苔吸收NO3--N,这是因为Zn(II)和Cu(II)一样,也是在低浓度时为藻类生物代谢所必须的微量营养元素,且Zn(II)在保持蛋白核的完整性方面起着重要作用[26].当Zn(II)的实验浓度为0.20mg/L时,则会明显的抑制浒苔对NO3--N的吸收.在生理生化方面表现为抑制细胞分裂,影响光合作用,叶绿素含量的下降[27],以及类胡萝卜素与叶绿素比率失调[28].

魏海峰等[15]研究了Zn(II)对孔石莼吸收总氨氮的胁迫作用,发现当Zn(II)浓度为0.50mg/L 时,其对孔石莼吸收总氨氮的抑制作用并不明显,当总氨氮的初始浓度为0.25～1.00mg/L时,抑制率约为5%;当Zn(II)浓度超过1.00mg/L时,孔石莼对总氨氮的吸收速率开始下降,并且Zn(II)浓度越高,其对孔石莼吸收氨氮的抑制作用越明显.本研究的实验结果与上述结果基本一致.

2.3 添加Pb(II)对浒苔吸收NO3--N的影响

由图5可见,Pb(II)在实验浓度范围内,其吸收速率均比对照组小.当Pb(II)浓度为0.03～ 0.20mg/L时,Pb(II)对浒苔吸收NO3--N的影响明显比其他浓度的Pb(II)要大.当NO3--N的浓度为10～20µmol/L,浒苔对NO3--N的吸收速率随Pb(II)浓度的不同变化不明显.这与添加Cu(II)、Zn(II)的实验组情况一致.

图5　不同Pb(II)浓度下浒苔对NO3--N吸收速率Fig.5　The uptake rates of nitrate by Ulva prolifera at different Pb(II) concentrations

将图5中浒苔对NO3--N吸收速率与不同Pb(II)浓度的关系经过米氏方程拟合(R2> 0.99),得到动力学参数Vmax和Ks(表3).结果发现,与对照组相比,添加Pb(II)的各实验组浒苔吸收NO3--N的动力学参数均变小,这表明加入Pb(II)后浒苔对NO3--N的亲和力增加,但吸收速率相对下降.

表3　不同Pb(II)浓度条件下浒苔对NO3--N吸收动力学参数Table 3　The kinetic parameters related to nitrate uptake by Ulva prolifera under different concentrations of Pb(II)

根据测定的最大吸收速率,以不添加Pb(II)的空白组为对照,计算不同浓度下重金属对浒苔吸收NO3--N的抑制率(式2).再根据式(4)对浒苔吸收NO3--N最大吸收速率的抑制率与不同Pb(II)浓度之间进行方程拟合(图6).可以发现,当抑制率IP=0.5时,重金属Pb(II)的浓度为0.63mg/L.

图6　不同Pb(II)浓度对浒苔吸收NO3--N最大吸收速率的抑制率Fig.6　The effects of Pb(II) on the maximum absorption rate of nitrate uptake by Ulva prolifera

结合表3和图6可以看出,对于添加不同Pb(II)浓度的各实验组(0.03～1.00mg/L),浒苔对NO3--N的Vmax值均小于对照组,且抑制率IP均大于0.说明对于浒苔而言,Pb(II)始终是抑制浒苔对NO3--N的吸收,且Pb(II)浓度越大,其抑制作用越强(P<0.05).Pb(II)影响浒苔吸收NO3--N的原因可能是Pb(II)与蛋白质中的巯基相结合,从而使蛋白质活性改变,或使生物膜发生过氧化作用,植物吸收运输功能下降,致使必须元素缺乏,叶绿素等生物合成减弱,导致吸收NO3--N能力下降[29].而在浒苔生理生化方面则表现出可溶性糖、蛋白质、叶绿素含量的下降[30].

目前,关于Pb(II)对浮游植物的生态毒理学研究还较少,其致毒机理尚不十分清楚.有关报道指出,Pb(II)在浮游藻类体内可以积累.当Pb(II)浓度较高时,其会和海藻细胞内的氨基酸发生络合而抑制其光合作用[31].吴瑜端等[32]研究发现,Pb(II)会对海藻体内脱氧核糖核酸DNA的复制与转录产生影响,且会降低蛋白质合成过程中核糖核酸RNA翻译的精确度,进而影响海藻的生长.

另外,对Cu(II)、Zn(II)、Pb(II)3种重金属元素在同一添加浓度时对浒苔吸收NO3--N的动力学参数和抑制率进行对比,结果表明,当重金属元素处于较低浓度(0.03mg/L)时,浒苔对NO3--N吸收的Vmax值分别为38.91,39.22,34.48µmol/(g·h),对照组Vmax值为37.04µmol/(g·h),而抑制率IP分别为-0.05、-0.06、0.07,说明较低浓度的Cu(II) 和Zn(II)在一定程度上可以促进浒苔对NO3--N的吸收,而Pb(II)却对浒苔吸收NO3--N始终表现出不同程度的抑制作用.当3种重金属处于较高浓度(>0.5mg/L)时,浒苔对NO3--N吸收的Vmax值均小于对照组,抑制率IP为0.36～0.67,说明较高浓度的重金属均会抑制浒苔对NO3--N的吸收,其抑制作用的大小顺序为Cu(II)>Pb(II)>Zn(II).重金属对浮游植物的的毒性研究比较多,尽管所选的浮游植物不同,且研究者所采用的实验条件也不相同,但几种常见的重金属对浮游藻类的毒性顺序为Hg> Cu≈Cd>Cr>Zn>Pb[33].本研究中重金属毒性大小顺序与之不完全一致,这可能是与本研究的实验材料选取大型海藻—浒苔有关.但不论对浮游植物还是大型海藻,重金属Cu对其毒性效应都是不容忽视的.

实验选取的实验材料为近年来黄海绿潮暴发的“肇事种”.浒苔绿潮一般在每年的4月中旬出现在苏北浅滩,之后在风和流的作用下逐渐向北漂移并不断扩散,最终在8月左右大量堆积在青岛海岸[34-36].田琳等[37]研究了2007年春季和秋季北黄海表层海水Cu(II)、Pb(II)、Zn(II)3种重金属元素的平均浓度,春季分别为(0.8±0.6), (3.8±1.6),(0.35±0.22)µg/L,秋季分别为(1.4±0.9), (8.1±1.7),(0.40±0.68)µg/L.史华明等[38]研究指出,2007年春季和秋季北黄海的NO3--N的平均浓度分别为(1.49±2.02),(3.74±3.12)µmol/L,表现为春季明显的低于秋季.结合本研究的实验结果可以发现,Cu(II)、Zn(II)两种重金属会在春秋季促进该海域浒苔对NO3--N的吸收,但Pb(II)则会抑制浒苔吸收NO3--N,而NO3--N已被证明是浒苔藻体生长繁殖的首要营养元素[2,39].因此,春秋季不同浓度的Cu(II)、Pb(II)、Zn(II)3种重金属在不同程度上影响着浒苔对NO3--N的吸收,进而促进或抑制浒苔的生长.而春秋季正好是浒苔暴发的前期和末期,进一步推测,3种重金属对浒苔绿潮的生消发展起到间接的影响作用.

3　结论

3.1 重金属对浒苔吸收NO3--N的室内培养实验表明:不同重金属对浒苔吸收NO3--N的影响作用不同.当Cu(II)<0.04mg/L,Zn(II)<0.12mg/L时可以促进浒苔吸收NO3--N,当Cu(II)>0.10mg/ L,Zn(II)>0.20mg/L则产生明显抑制作用,Pb(II)对浒苔吸收NO3--N始终表现为抑制作用.

3.2 Cu(II)、Zn(II)、Pb(II)对浒苔吸收NO3--N的最大吸收速率的抑制率IPC50分别为0.23,0.66, 0.63mg/L.

3.3 当Cu(II)、Zn(II)、Pb(II)浓度大于0.50mg/L 时,重金属对浒苔吸收NO3--N的抑制大小为: Cu(II)>Pb(II)>Zn(II).

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Effects of heavy metals on the uptake of nitrate by Ulva prolifera.

WU Lao-wu1,2, HAN Xiu-rong1,2, WU Ting3, DU Jin1,2, SHI Xiao-yong1,2,3*(1.College of Chemistry and Chemical Engineering, Ocean University of China, Qingdao 266100, China；2.Laboratory of Marine Chemistry Theory and Technology, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266100, China；3.National Marine Hazard Mitigation Service, Beijing 100194, China). China Environmental Science, 2016,36(4)：1173～1180

Abstract：In order to investigate the response of the macroalgae to heavy metal contamination, the influence of three heavy metal ions (Cu(II), Zn (II) and Pb (II)) on the uptake of nitrate by Ulva prolifera was investigated. Kinetic parameters related to nitrate uptake in different trials were determined by the batch culture experiment in the laboratory. The results showed that the uptake of nitrate by Ulva prolifera was promoted at low concentrations of Cu (II) (<0.04mg/L) and Zn (II) (<0.12mg/L) and inhibited at high concentrations (Cu (II)>0.10mg/L and Zn (II)>0.20mg/L). Pb (II) played a negative role in the uptake of nitrate by Ulva prolifera at all tested concentrations. The inhibition rate of the maximum absorption rate of nitrate (Vmax) were calculated to be 0.23mg/L, 0.66mg/L, and 0.63mg/L for Cu(II), Zn(II), and Pb(II), respectively. The inhibition effects of the three heavy metals at concentrations >0.5mg/L on Ulva prolifera nitrate uptake were observed to be in the order of Cu(II)>Pb(II)>Zn(II).

Key words：Ulva prolifera；nitrate；heavy metals

作者简介：吴老五(1991-),女,安徽安庆人,硕士研究生,主要研究方向海洋污染生态化学.

基金项目：国家重点基础研究发展规划(973)项目(2010CB428701)

收稿日期：2015-09-30

中图分类号：X171.5

文献标识码：A

文章编号：1000-6923(2016)04-1173-08